山羊DCT基因啟動(dòng)子活性區(qū)及其轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控探究

劉春楊，張樂超，王 麒，周榮艷，李蘭會(huì)*，李祥龍

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定 071000； 2.河北科技師范學(xué)院，秦皇島 066004)

定位于黑素體膜上的跨膜蛋白—多巴色素異構(gòu)酶 (Dopachrometautomerase，DCT)，也稱作酪氨酸酶相關(guān)蛋白2 (TYRP2)，參與黑色素的生物合成過程[1-2]，1992 年被確認(rèn)為酪氨酸酶相關(guān)蛋白家族的第3個(gè)成員，具有多巴色素異構(gòu)酶(DT)活性，催化多巴色素轉(zhuǎn)變?yōu)?, 6-二羥基吲哚羧酸( DHICA)，具有加速黑色素生成的作用。黑色素細(xì)胞中的DCT基因控制著5, 6-二羥基吲哚羧酸與5,6-二羥基吲哚(DHI)的比例，因此推測，DCT可能對黑色素合成早期階段的酪氨酸酶催化活性有調(diào)節(jié)作用，對動(dòng)物毛色形成發(fā)揮重要作用[3-4]。而且，由于中間產(chǎn)物DHI在體內(nèi)比DHICA有更高的細(xì)胞毒性，DCT能使含有羧酸前體的DHICA迅速摻入生物合成的黑色素內(nèi)，對減少中間產(chǎn)物的細(xì)胞毒性有重要意義[5-6]。據(jù)前人研究，DCT基因單堿基變異的小鼠，與野生型黑色小鼠相比，DCT活性降低了3～4倍，從而產(chǎn)生了深灰或深棕色小鼠[7]。DCT基因突變的小鼠黑色素細(xì)胞過早死亡，可能是由于 DCT 缺失而產(chǎn)生的細(xì)胞毒性中間體所致[8]。也有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠敲除DCT第一外顯子后導(dǎo)致DCT基因mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量缺失，影響了黑色素細(xì)胞的活性和色素沉著，形成深灰色被毛[9]。

鑒于DCT基因表達(dá)在動(dòng)物毛色和生命活動(dòng)中的重要作用，其表達(dá)水平受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控[10-11]，因此，研究DCT基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理對于揭示動(dòng)物毛色形成具有重要作用。SOX10是調(diào)控DCT基因表達(dá)的一個(gè)非常重要的轉(zhuǎn)錄因子[12]，體外試驗(yàn)表明，SOX10能夠激活DCT基因啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄[13-14]。MITF也是黑色素合成過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，有研究認(rèn)為，DCT基因的表達(dá)是依靠MITF與SOX10兩種轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同激活的[15-16]，也有研究認(rèn)為，DCT可能存在不依賴于MITF的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[17-19]。人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子OTX2能夠結(jié)合到DCT基因的啟動(dòng)子區(qū)，抑制內(nèi)源OTX2的表達(dá)導(dǎo)致DCT蛋白含量的減少，說明OTX2能夠激活DCT基因啟動(dòng)子[20]。

本試驗(yàn)克隆山羊DCT基因5′UTR區(qū)序列，并構(gòu)建DCT基因系列缺失片段的pGL3-Basic重組質(zhì)粒，利用點(diǎn)突變方法構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子SOX10、MITF和OTX2結(jié)合位點(diǎn)突變的DCT基因系列重組質(zhì)粒，以Luciferase報(bào)告基因系統(tǒng)檢測重組質(zhì)粒的啟動(dòng)活性變化，明確該基因啟動(dòng)子核心調(diào)控區(qū)和轉(zhuǎn)錄因子對DCT基因的表達(dá)調(diào)控，以期為山羊DCT基因的表達(dá)調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

pGL3-Basic 與 pRL-TK 載體、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒為美國 Promega 公司產(chǎn)品；脂質(zhì)體Lipofectamine?2000 Reagent為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；Opti-MEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基為美國Hyclone公司產(chǎn)品；TransStartTaqDNA 聚合酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、點(diǎn)突變試劑盒為北京全式金公司產(chǎn)品；感受態(tài)細(xì)胞DH5α、膠回收試劑盒為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品；閃電克隆試劑盒為北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司產(chǎn)品；內(nèi)切酶為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒為北京天根公司產(chǎn)品。引物合成由上海生工生物工程有限公司完成，測序由北京六合華大基因公司完成。

績效管理工作的有效推進(jìn)可以很大程度上激發(fā)工作人員的工作積極性，并保證全部管理活動(dòng)能夠在績效管理體系建設(shè)的過程中實(shí)現(xiàn)更大的價(jià)值。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將回收的山羊DCT基因系列缺失片段與線性化載體進(jìn)行連接重組，反應(yīng)體系：目的片段400 ng，載體20 ng，2×Lightening Cloning Master Mix 5 μL，ddH2O補(bǔ)足至10 μL，50 ℃水浴1 h。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，鑒定為陽性的單菌落送公司測序，確定為陽性克隆，進(jìn)一步進(jìn)行重組質(zhì)粒的大量提取。

根據(jù)點(diǎn)突變試劑盒說明書，應(yīng)用PCR方法實(shí)現(xiàn)堿基突變。PCR反應(yīng)體系：原質(zhì)粒載體DNA 20～50 ng，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，2×TransStart?FastPfu PCR SuperMix 25 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性20 s，退火溫度退火20 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃終止反應(yīng)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若有目的條帶，加1 μL DMT酶于10 μL PCR產(chǎn)物中，37 ℃消化孵育1 h。將消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到50 μL DMT感受態(tài)細(xì)胞中，涂布到含氨芐的培養(yǎng)皿，挑取單菌落，送至華大測序。成功實(shí)現(xiàn)突變的載體進(jìn)行質(zhì)粒的大量提取，為轉(zhuǎn)染做準(zhǔn)備。

利用特異引物(表1)擴(kuò)增山羊DCT基因上游序列5′端缺失片段，分別命名為P1、P2、P3、P4和P5。根據(jù)第一輪啟動(dòng)子預(yù)測片段活性值，以P3片段序列為模板，設(shè)計(jì)一系列3′端缺失序列引物，分別命名為P6、P7、P8、P9、P10和P11。

表1山羊DCT基因啟動(dòng)子擴(kuò)增引物

Table1PrimersamplifyinggoatDCTgenepromoterswithdifferentlength

小寫字母為與載體的重疊區(qū)序列；下劃線標(biāo)記為所用酶切位點(diǎn)；大寫字母為引物特異性序列

Lowercase letters are overlap regions with the vectors; underlined letters are restriction enzyme digestion sites; uppercase letters are the specifical primer sequences

1.2.2 山羊DCT基因啟動(dòng)子系列缺失片段的克隆 PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)4 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，DNA模板2.5 μL，TransStartTaq酶(2.5 U·μL-1)0.5 μL，最后ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火溫度退火30 s，72 ℃延伸0.5～2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃終止反應(yīng)。利用1%瓊脂糖凝膠對 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，若條帶單一且為目的條帶，直接進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，若條帶復(fù)雜但含有目的條帶，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化回收處理。

1.2.3 載體質(zhì)粒的線性化 根據(jù)設(shè)計(jì)引物時(shí)所加酶切位點(diǎn)，利用SacI和XhoI兩種限制性內(nèi)切酶將載體pGL3-Basic進(jìn)行雙酶切處理，實(shí)現(xiàn)載體的線性化。載體雙酶切體系：載體質(zhì)粒1 500 ng，10×M Buffer 6 μL，SacI和XhoI各1.5 μL，H2O補(bǔ)足至60 μL，37 ℃反應(yīng)3～4 h，將反應(yīng)液進(jìn)行切膠回收。

基于對青少年自我價(jià)值感及道德判斷能力與價(jià)值觀關(guān)系的研究，在自我價(jià)值感中，自我觀與人際情感之間具有正向關(guān)系，其他則為負(fù)向。換言之，自我觀越重的學(xué)生，其自我價(jià)值感越強(qiáng)，并以此更加關(guān)注自身的成長，形成良性循環(huán)。與此同時(shí)，群體觀與自我價(jià)值感卻存在著互相關(guān)聯(lián)，自我觀強(qiáng)導(dǎo)致群體觀低、人際價(jià)值感高。

1.2.1DCT基因啟動(dòng)子系列缺失片段引物設(shè)計(jì) 以山羊DCT基因序列(NCBI收錄號(hào)：NC_030819.1)為模板，利用在線引物設(shè)計(jì)程序NEBuilder(http://nebuilder.neb.com/)設(shè)計(jì)特異引物，在上游引物5′端引入SacI的酶切位點(diǎn)及部分與表達(dá)載體的重疊區(qū)，下游引物5′端引入XhoI的酶切位點(diǎn)及部分與表達(dá)載體的重疊區(qū)。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)點(diǎn)突變載體的構(gòu)建 利用轉(zhuǎn)錄因子在線分析軟件JASPAR(http://jaspar.genereg.net/cgi-bin/jaspar_db.pl)對啟動(dòng)子活性值最高的片段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析。根據(jù)不改變DCT基因其它轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的原則，按照點(diǎn)突變說明書，對啟動(dòng)子活性值最高片段設(shè)計(jì)突變轉(zhuǎn)錄因子SOX10、MITF和OTX2結(jié)合位點(diǎn)的引物，命名為TB1、TB2、TB3、TB4、TB5和TB6(表2)。TB1將-846和-845 bp位置GT突變?yōu)門A，TB2將-617 和-616 bp位置GT突變?yōu)镃A，而TB3將-604和-603 bp位置CA突變?yōu)锳G，從而使三者的SOX10結(jié)合位點(diǎn)消失。TB4將-410 bp的C突變?yōu)锳，TB5將-310 bp的C突變?yōu)锳，使MITF結(jié)合位點(diǎn)消失。TB6將-277 bp的A突變成C，使轉(zhuǎn)錄因子OTX2結(jié)合位點(diǎn)消失。

表2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)突變引物

Table2Primersofpointmutationintranscriptionfactorbindingsite

引物Prim-er轉(zhuǎn)錄因子TFs上游引物(5'-3')Forwardprimer下游引物(5'-3')Reverseprimer退火溫度/℃TmTB1SOX10AGTCTGTCCAACCCTTTTAGACC-CCGTGGTAAAAGGGTTGGACAGACTGAA-ATGACT59TB2SOX10GAAGAGGATCCCTCATCATGAAC-TGTGAATGATGAGGGATCCTCTTCTCTC-CAAAGA59TB3SOX10ATTGTGAACTGTGAAAAGAAGCA-ATTCCTCTTTTCACAGTTCACAATGAG-GGATCCT59TB4MITFTAGGAAGTCTGAGGTAACAAGCTTGGTACCTCAGACTTCCTAGGGAGTCAA58TB5MITFTTGTGCGCTCTGGGTAATGTGCTAACTACCCAGAGCGCACAATGAAGTAGA59TB6OTX2ATTTGTCTAATACTACTCCTGCTAATGTAGTATTAGACAAATCCCCATCGT53

下劃線處為突變堿基

Underlined letters are mutant bases

從“宏大敘事”轉(zhuǎn)向“微小敘事”—從英雄、模范的典型事跡轉(zhuǎn)向平民百姓的生活事件；從隱身敘事轉(zhuǎn)到自傳敘事—從講述別人的故事到自己“親歷”的故事；從“社會(huì)劇本”轉(zhuǎn)到“生活劇本”—把學(xué)生當(dāng)下身邊發(fā)生的道德事件作為教材的出發(fā)點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)細(xì)微小事和典型事例中隱藏的道德智慧。

風(fēng)險(xiǎn)投資在近年“共享經(jīng)濟(jì)”的飛速發(fā)展中被人所熟知，是投資中介向特別有潛能的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)投入風(fēng)險(xiǎn)資本后，實(shí)現(xiàn)利益共享、風(fēng)險(xiǎn)共擔(dān)的一種投資方式。大學(xué)生創(chuàng)業(yè)遇到的最大問題就是資金不足。以Dormi為例，在校創(chuàng)業(yè)階段，有政府提供的項(xiàng)目資金與學(xué)校舉辦相關(guān)活動(dòng)的獎(jiǎng)金。在轉(zhuǎn)型進(jìn)入更大市場時(shí)，依靠前期盈利與創(chuàng)始團(tuán)隊(duì)家庭支持是不夠的，必須尋求社會(huì)資金的幫助。對于風(fēng)險(xiǎn)投資公司來說，他們也希望尋找到有發(fā)展?jié)摿Φ闹行⌒晚?xiàng)目，通過早期“資本換股權(quán)”，從而在未來公司成熟后以更高價(jià)格將股權(quán)賣出獲得收益[2]。

顛覆潮流，打破“長”規(guī)，全新梅賽德斯-奔馳長軸距A級(jí)轎車以實(shí)力向世人揭示—這才是新生代豪華轎車該有的樣子！此次上市車型包括全新A 180 L轎車及運(yùn)動(dòng)轎車、全新A 200 L轎車及運(yùn)動(dòng)轎車，以及全新A 200 L運(yùn)動(dòng)轎車先型特別版共 5款車型，廠商建議零售價(jià)格區(qū)間為人民幣21.69萬元至29.99萬元。

2 結(jié) 果

2.1 山羊DCT基因啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控元件分析

NCBI數(shù)據(jù)庫中下載山羊DCT基因(NC_030819.1)，并與人和鼠DCT基因啟動(dòng)子序列相比，山羊DCT基因的-648～+73 bp(外顯子1第1個(gè)堿基記為+1)區(qū)域與人的相似度達(dá)81%，-472～-28 bp區(qū)域與鼠DCT基因啟動(dòng)子序列相似度達(dá)78%。

對目的序列進(jìn)行啟動(dòng)子特征分析，發(fā)現(xiàn)多種調(diào)控元件(圖1)：包含6個(gè)TATA box，分別位于-382～-366 bp、-337～-321 bp、-205～-189 bp、-187～-172 bp、-125～-109 bp和+774～+790 bp；位于-138～-123 bp的GC box；位于-188～-175 bp 的CAAT box；位于-313～-303 bp的M box和位于-620～-588 bp 的32 bp元件。

圖1 山羊DCT基因序列特征圖Fig.1 Sequence feature of goat DCT gene

利用在線程序Meth Primer (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi) 對山羊DCT基因-2 000～+1 000 bp序列進(jìn)行CpG島預(yù)測分析，參數(shù)設(shè)置為Island size ≥100，Obs/Exp ≥0.6，GC Percent ≥50.0。在3 000 bp的序列中，共存在2處CpG島，分別位于該基因的-93～+7 bp和+309～+603 bp(圖1)。

1.2.6 山羊DCT基因啟動(dòng)子活性檢測 A375細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在 5% CO2和 37 ℃條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d以每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔培養(yǎng)板，以不含血清及抗生素的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%，根據(jù)Lipofectamine?2000 Reagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明開始轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體與質(zhì)粒總量比例為2∶1，pGL3-promoter質(zhì)粒與pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染比例為19∶1。轉(zhuǎn)染后 48 h 裂解細(xì)胞，利用雙熒光素酶檢測試劑盒，GloMax-MultiJr 單管型多功能檢測儀檢測熒光素酶活性。

利用Promoter 2.0預(yù)測山羊DCT基因-801、-501和+200 bp 3個(gè)位置為啟動(dòng)子位置，分值分別為0.657、0.692和0.621。

2.2 山羊DCT基因啟動(dòng)子缺失片段載體的構(gòu)建

5′和3′系列缺失序列片段的PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測見圖2，可見目的條帶單一，亮度清晰，無雜帶。圖2中P1、P2、P3、P4和P5片段分別長2 059、1 598、1 222、775和436 bp，P6、P7、P8、P9、P10和P11片段分別長1 024、778、728、690、650和356 bp。

將PCR產(chǎn)物純化回收，與線性化表達(dá)載體混合，加入重組酶，使目的片段與線性化表達(dá)載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，陽性克隆送華大公司測序，測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，證明重組載體構(gòu)建成功。

(4)借助社會(huì)專業(yè)力量，對企業(yè)進(jìn)行流程進(jìn)行梳理，提升核心競爭力。國家有一整套完善的《企業(yè)內(nèi)部控制規(guī)范》屬理論范疇，指引企業(yè)內(nèi)部風(fēng)險(xiǎn)控制。但是，企業(yè)內(nèi)控成本與企業(yè)實(shí)際工作的有效結(jié)合，成本效益原則的尺度不好掌握。往往造成的結(jié)果是高成本全覆蓋，有事大家都有責(zé)，沒人擔(dān)當(dāng)，沒有責(zé)任人，也沒有經(jīng)濟(jì)成果，無為就無責(zé)。企業(yè)應(yīng)以實(shí)際經(jīng)營工作及流程為出發(fā)點(diǎn)，聘請社會(huì)專業(yè)力量，對企業(yè)流程進(jìn)行梳理，縮短管理鏈條，根據(jù)重要性原則和關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)實(shí)施有效控制，有法滿足的實(shí)施替代內(nèi)控復(fù)核程序，提升管理效率，找到成本與效益的最佳結(jié)合點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)國有企業(yè)的價(jià)值最大化。

2.3 重組質(zhì)粒啟動(dòng)子活性分析

雖然P9片段的基本調(diào)控元件與P10片段相同，但P9卻表現(xiàn)出極顯著高于P10的啟動(dòng)子活性(P<0.01)，說明-232～-192 bp間存在重要調(diào)控元件，1個(gè)TATA box(-205～-189 bp)，增加DCT基因的轉(zhuǎn)錄活性。P8片段增加1個(gè)TATA box(-187～-172 bp)和1個(gè)CAAT框(-188～-175 bp)，其活性表現(xiàn)為最高，比陰性對照高出20.26倍，極顯著高于其它所有片段(P<0.01)，推測-192～-154 bp間的CAAT box為DCT基因的關(guān)鍵調(diào)控元件，發(fā)揮增強(qiáng)子作用。

M. DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；P1～P11. 系列缺失片段M. DNA marker; P1-P11. The series of deleted fragments圖2 DCT基因系列缺失片段PCR產(chǎn)物凝膠檢測圖Fig.2 Agarose gel electropherogram of PCR products of the serial deleted fragments of DCT gene

不同片段顯示出不同的熒光活性，說明啟動(dòng)子不同區(qū)域存在不同作用的重要調(diào)控元件。由P5、P4至P3片段長度增加，啟動(dòng)子活性逐漸增加推測，山羊DCT基因核心啟動(dòng)子區(qū)可能位于-990～-204 bp范圍內(nèi)，與Promoter 2.0預(yù)測的-801和-501 bp啟動(dòng)子位置結(jié)論一致；-204～+232 bp區(qū)域內(nèi)可能存在負(fù)調(diào)控元件，與該區(qū)域內(nèi)的CpG島(-93～+7 bp)和GC box(-138～-123 bp)有關(guān)，或正調(diào)控元件不能發(fā)揮啟動(dòng)作用。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS 17.0軟件的ANOVA對系列缺失片段活性進(jìn)行分析，采用LSD多重比較對每個(gè)檢測片段的啟動(dòng)子活性作兩兩比較。對點(diǎn)突變載體利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較突變前后活性變化。P<0.01表示差異極顯著。

由驗(yàn)證結(jié)果可知，所有的觀測變量與其對應(yīng)的具體因素之間都具有顯著性關(guān)系。再通過表4可發(fā)現(xiàn)，智慧城市感知質(zhì)量、感知價(jià)值以及發(fā)展水平都與智慧城市建設(shè)市民滿意度呈顯著正相關(guān)；智慧城市市民抱怨、智慧城市預(yù)期與智慧城市建設(shè)市民滿意度負(fù)相關(guān)是顯著的；智慧城市感知價(jià)值、智慧城市發(fā)展水平、智慧城市預(yù)期都與智慧城市感知質(zhì)量正相關(guān)是顯著的；智慧城市感知價(jià)值、智慧城市發(fā)展水平與智慧城市預(yù)期呈正相關(guān)且是顯著的；智慧城市感知價(jià)值、智慧城市發(fā)展水平與智慧城市市民抱怨呈負(fù)相關(guān)且是顯著的；智慧城市預(yù)期與智慧城市市民抱怨呈正相關(guān)但不顯著。在圖2中，用實(shí)線代表該影響路徑具有顯著性，用虛線代表該影響路徑不具有顯著性。

以-990～+232 bp的P3片段序列為模板，構(gòu)建系列3′端缺失序列報(bào)告基因載體P6～P11，5′端固定在-881 bp位置，3′端依次縮短。如圖1所示，片段P6(-881～+143 bp)包含32 bp元件、M box、CAAT box、GC box、CpG島和5個(gè)TATA box；片段P7(-881～-104 bp)在P6基礎(chǔ)上缺少CpG島；P8(-881～-154 bp)在P7基礎(chǔ)上缺少GC box和TATA box；P9(-881～-192 bp)在P8基礎(chǔ)上缺少1個(gè)CAAT box和2個(gè)TATA box；P10(-881～-232 bp)和P9所包含調(diào)控元件相同；片段P11(-881～-526 bp)只包含32 bp元件。

圖3顯示，片段P6～P10活性值均極顯著高于陰性對照組(P<0.01)，P11活性值與陰性對照差異不顯著(P>0.01)，說明包含預(yù)測啟動(dòng)子位置-801 bp的P11片段僅有32 bp元件并不能啟動(dòng)DCT基因的表達(dá)，必須與其他調(diào)控元件結(jié)合共同發(fā)揮啟動(dòng)活性。P10片段增加了2個(gè)TATA box和1個(gè)M box，其啟動(dòng)活性極顯著高于P11(P<0.01)。這不僅驗(yàn)證了5′系列缺失片段活性檢測結(jié)果，并進(jìn)一步精確核心啟動(dòng)子區(qū)為-881～-232 bp區(qū)，說明包含2個(gè)預(yù)測啟動(dòng)子位置-801 和-501 bp的P10，具有32 bp元件(-620～-588 bp)與2個(gè)TATA box(-382～-366 bp與-337～-321 bp)和1個(gè)M box(-313～-303 bp)組合發(fā)揮了基本轉(zhuǎn)錄活性。

表達(dá)載體pGL3-Basic與5′系列缺失片段重組，獲得報(bào)告基因載體pGL3-P1～pGL3-P5，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞，細(xì)胞狀態(tài)良好，轉(zhuǎn)染后48 h收獲并裂解細(xì)胞，檢測螢火蟲熒光素酶熒光值(F)和海腎熒光素酶熒光值(R)，計(jì)算相對熒光素酶活性，即F/R值。結(jié)果顯示(圖3)，P1(-1 827～+232)、P2(-1 366～+232)、P3(-990～+232)和P4(-543～+232)片段活性均極顯著高于陰性對照組(P<0.01)，P3活性極顯著高于其它片段(P< 0.01)，但P5(-204～+232)活性與陰性對照差異不顯著(P>0.01)。

片段P7和P6增加了GC box(-138～-123 bp)、CpG島(-93～+7 bp)和1個(gè)TATA box，其活性極顯著低于P8和P9(P<0.01)，說明-154～+143 bp區(qū)域存在的GC box和CpG島發(fā)揮了負(fù)調(diào)控作用，與5′系列缺失片段發(fā)現(xiàn)的-204～+232 bp的負(fù)調(diào)控結(jié)果一致。

2.4 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)點(diǎn)突變報(bào)告基因載體構(gòu)建及活性分析

以P8報(bào)告基因載體質(zhì)粒為模板，使用點(diǎn)突變試劑盒構(gòu)建點(diǎn)突變報(bào)告基因片段TB1～TB6，PCR產(chǎn)物為環(huán)狀，大小為5 525 bp，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖4所示。

課題組設(shè)計(jì)調(diào)查表，對各地市食藥檢機(jī)構(gòu)的人員數(shù)量、編制、職稱、學(xué)歷情況進(jìn)行調(diào)查，于2015年8月5日通過廣西食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)放給8家地市級(jí)食品藥品檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)填報(bào)，2015年9月5日前收回問卷。本次調(diào)查共發(fā)放問卷8份，回收8份，由課題組對數(shù)據(jù)進(jìn)行核實(shí)和匯總。

不同大寫字母代表差異極顯著(P<0.01)，相同大寫字母代表差異不顯著(P>0.01)Columns with different upper case letters mean highly significant difference (P<0.01); Columns with the same upper case letter mean no significant difference (P>0.01)圖3 系列缺失片段熒光素酶相對活性值Fig.3 Luciferase relative activity of serial deleted fragments

TB1～TB6. 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)點(diǎn)突變報(bào)告基因片段；M. DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)TB1-TB6. Reporter gene fragments with point mutation of transcription factor binding site; M. DNA marker 圖4 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)點(diǎn)突變片段擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Amplification result of point mutation fragments for transcription factor binding sites

圖5顯示，使SOX10結(jié)合位點(diǎn)消失的突變載體TB1(-846和-845 bp)、TB2(-617和-616 bp)和TB3(-604和-603 bp)活性較突變前活性極顯著降低(P<0.01)，推測轉(zhuǎn)錄因子SOX10與DCT基因在核心啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合對轉(zhuǎn)錄表達(dá)起到正調(diào)控作用。而引起MITF和OTX2結(jié)合位點(diǎn)消失的突變載體TB4(-410 bp)、TB5(-310 bp)和TB6(-277 bp)啟動(dòng)子活性較突變前極顯著增強(qiáng)(P<0.01)，推測轉(zhuǎn)錄因子MITF和OTX2對山羊DCT基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)起到負(fù)調(diào)控的作用或DCT基因存在不依賴于MITF和OTX2的其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。

3 討 論

3.1 利用山羊DCT基因5′和3′系列缺失片段活性檢測核心啟動(dòng)子區(qū)

啟動(dòng)子的檢測方法有多種，最常見的就是報(bào)告基因的方法，基本方式就是將生物信息學(xué)預(yù)測與試驗(yàn)相結(jié)合，根據(jù)預(yù)測結(jié)果有目的地設(shè)計(jì)試驗(yàn)，更快地找到核心啟動(dòng)子區(qū)[21-25]。本試驗(yàn)在DCT基因序列中發(fā)現(xiàn)了CpG島、TATA box、GC box、CAAT box、M box和32 bp元件，這些都是啟動(dòng)子附近的標(biāo)志性元件。而且，通過與GeneCopoeia上公布的人和小鼠DCT基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)高度相似性序列也覆蓋了這些元件。根據(jù)這些序列特征，再參考在線啟動(dòng)子預(yù)測結(jié)果，首先構(gòu)建了一系列5′端序列缺失報(bào)告基因載體，最長片段為2 059 bp。結(jié)果顯示，位于-990～+232 bp位置的片段啟動(dòng)子活性值最高，不同缺失片段之間啟動(dòng)子活性都存在極顯著差異，根據(jù)活性變化情況可推測出-990～-204 bp區(qū)域內(nèi)可能存在正調(diào)控元件，在-1 366～-990 bp區(qū)域內(nèi)可能存在負(fù)調(diào)控元件。結(jié)合對基因序列特征的分析，發(fā)現(xiàn)片段P4的活性比P3活性顯著降低，在P3片段序列中包含32 bp元件，而P4片段中則沒有，此元件已被證實(shí)是DCT基因在色素細(xì)胞表達(dá)中所必需的[5]，因此可推測，32 bp元件對山羊DCT基因的轉(zhuǎn)錄起正調(diào)控作用。

圖5 點(diǎn)突變報(bào)告基因載體與模板P8載體熒光素酶相對活性Fig.5 Luciferase relative activity of mutational and original reporter gene vectors and fragment P8

根據(jù)5′系列啟動(dòng)子缺失片段活性檢測結(jié)果，在最高活性-990～+232 bp片段的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一系列3′端序列缺失報(bào)告基因載體，最長片段為1 024 bp。啟動(dòng)子活性檢測發(fā)現(xiàn)，-881～-154 bp片段的啟動(dòng)子活性最高，該序列包括32 bp元件、M box和2個(gè)TATA box，推測這些調(diào)控元件組合可維持山羊DCT基因的基本轉(zhuǎn)錄。不同缺失片段啟動(dòng)子活性之間都存在顯著差異，根據(jù)活性變化情況可推測核心啟動(dòng)子區(qū)為-881～-232 bp區(qū)，該區(qū)域包含2個(gè)預(yù)測啟動(dòng)子位置，具有32 bp元件、2個(gè)TATA box和1個(gè)M box，這些元件組合發(fā)揮了基本轉(zhuǎn)錄活性。-192～-154 bp間的CAAT box為DCT基因的關(guān)鍵調(diào)控元件，發(fā)揮增強(qiáng)子作用。-154～+143 bp區(qū)域存在的GC box和CpG島，對DCT基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。

3.2 利用點(diǎn)突變DCT基因啟動(dòng)子活性片段檢測轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控作用

本試驗(yàn)在前人對不同物種DCT基因的研究基礎(chǔ)上，篩選出了3種與DCT基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子：SOX10、MITF和OTX2。通過點(diǎn)突變的方法引起轉(zhuǎn)錄因子SOX10結(jié)合位點(diǎn)消失后的3個(gè)片段活性均顯著降低，即SOX10能夠激活DCT基因的表達(dá)，這與前人研究結(jié)果一致[12-13]。另外，在5′端系列缺失報(bào)告基因載體中，片段P3的啟動(dòng)子活性要顯著高于P4，片段P10的啟動(dòng)子活性要顯著高于P11，而片段P3和P10序列中都包含了轉(zhuǎn)錄因子SOX10的3處結(jié)合位點(diǎn)，片段P4和P11則沒有SOX10的結(jié)合位點(diǎn)，這一結(jié)果進(jìn)一步說明了轉(zhuǎn)錄因子SOX10有促進(jìn)山羊DCT基因轉(zhuǎn)錄的作用。

而目前關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子MITF對DCT基因的調(diào)控作用尚存在一些爭議，有研究認(rèn)為，MITF能夠協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子SOX10刺激并激活DCT基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄[14-15]，也有研究認(rèn)為，DCT基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控不依賴于MITF，或者M(jìn)ITF對DCT基因發(fā)揮的是負(fù)調(diào)控作用[16-18]。本試驗(yàn)共突變了2處轉(zhuǎn)錄因子MITF的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果顯示，突變后片段的啟動(dòng)子活性都顯著增強(qiáng)，但在首輪啟動(dòng)子缺失片段中，片段P4序列包含了轉(zhuǎn)錄因子MITF的2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，而片段P5不包含，但片段P4的活性卻顯著高于片段P5，與MITF結(jié)合位點(diǎn)點(diǎn)突變的結(jié)果相矛盾，因此產(chǎn)生了2種推測結(jié)果：第一，轉(zhuǎn)錄因子MITF抑制DCT基因的表達(dá)，但由于片段P4序列中含有其它正調(diào)控元件，而這些正調(diào)控原件發(fā)揮了主要作用；第二，DCT基因可能存在其它不依賴MITF的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。轉(zhuǎn)錄因子OTX2對DCT基因調(diào)控作用的研究目前還不是很多，有研究表明，在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子OTX2能夠激活DCT基因的表達(dá)，但目前還沒有在黑色素細(xì)胞中的研究證明[20]。本試驗(yàn)通過定點(diǎn)突變改變轉(zhuǎn)錄因子OTX2的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果顯示，突變后片段啟動(dòng)子活性顯著上升，說明轉(zhuǎn)錄因子OTX2可能對山羊DCT基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。

本研究使用多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型綜合評(píng)價(jià)注射用雷貝拉唑鈉的藥理學(xué)作用。胃潰瘍模型有多種，目前比較常用的大鼠胃潰瘍模型主要有應(yīng)激性潰瘍（水浸應(yīng)激模型）、化學(xué)因素型胃潰瘍模型（吲哚美辛法、醋酸性）及幽門結(jié)扎型大鼠胃潰瘍模型等，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，相關(guān)技術(shù)也應(yīng)用到潰瘍模型制備的領(lǐng)域中，如基因敲除技術(shù)、蛋白缺失技術(shù)等［11］。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了5個(gè)5′端和6個(gè)3′端序列缺失啟動(dòng)子報(bào)告基因載體，確定山羊DCT基因啟動(dòng)子核心區(qū)位于-881～-232 bp區(qū)域；-192～-154 bp區(qū)域內(nèi)可能存在正調(diào)控元件，發(fā)揮增強(qiáng)子作用；-154～+143 bp區(qū)域存在的GC box和CpG島對DCT基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。轉(zhuǎn)錄因子SOX10對山羊DCT基因轉(zhuǎn)錄起正調(diào)控作用，而轉(zhuǎn)錄因子MITF和OTX2對山羊DCT基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用尚需繼續(xù)深入研究。

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