基于Cytb基因多態性研究西藏地區8個藏山羊群體遺傳結構及母系起源

鄧 娟，張紅平，巴 貴，次仁德吉，宋天增*，李 利*

(1.四川農業大學動物遺傳育種研究所，成都 611130； 2.西藏農牧科學院畜牧獸醫研究所，拉薩 850009)

藏山羊作為我國獨特的種質資源，其體型矮小，被毛富有光澤，顏色較雜，除白色和黑色較多外，還有青色、褐色等，在青藏高原的農業、經濟和文化，甚至宗教等方面都扮演了重要角色[1]，品種主要分布在西藏自治區全境、四川省甘孜和阿壩2個自治州、青海省玉樹和果洛藏族自治州、甘肅甘南藏族自治州及新疆部分地區[2]。高原環境的長期阻隔以及地理分布的差異，在長期的自然選擇和人工選擇下，藏山羊群體間缺乏足夠的基因交流，逐步形成了不同的生態類群。王杰等[3]、王永等[1]先后采用SSR與ISSR分子標記對藏山羊的遺傳多態性進行了分析，結果顯示，藏山羊多樣性較豐富，但群體間存在差異。在此次采樣過程中，筆者發現當地牧民大多以單戶養殖為主，一些產區(如城關鎮、林周縣、薩嘎縣等)的藏山羊群體數量已經極其稀少。加上近年來，在經濟利益的驅動下，各地也持續引入外來山羊品種，如遼寧絨山羊[4]、南江黃羊[5-6]、內蒙古白絨山羊[7]等對本地山羊品種進行遺傳改良，提高其綜合生產性能，導致藏山羊這一遺傳資源正在面臨危機。

線粒體基因組(Mitochondrial DNA，mtDNA)上的細胞色素b(Cytb)是蛋白編碼基因之一，其進化速度適中，序列片段包含種內到種間的進化遺傳信息，已被用來研究多個物種的系統發育關系和遺傳多樣性[8-9]。然而，利用Cytb基因對藏山羊的遺傳多樣性和分子進化方面的研究還未見報道。本研究對西藏地區8個群體共157個藏山羊個體的Cytb基因全序列進行擴增和測序，在此基礎上分析群體遺傳多樣性，揭示不同地域藏山羊群體間的遺傳結構及系統發育關系，為藏山羊品種資源的保護與利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

根據藏山羊的主產地區，從西藏8個地區采集藏山羊血液樣本共計157個，每個群體內的個體之間無親緣關系。采用頸靜脈采血，3.9% ACD抗凝，-20 ℃冰箱儲存備用。樣本詳細信息見表1。

表1藏山羊樣品采集信息

Table1SampleinformationofTibetangoats

群體Population海拔高度/mAltitude地理位置Location樣本數/頭Samplesize黑竹林藏山羊HZL5492西藏自治區拉薩市黑竹林30城關藏山羊CG3650西藏自治區昌都市卡若區城關鎮7當雄藏山羊DX4200西藏自治區拉薩市當雄縣40吉隆藏山羊JL4000西藏自治區日喀則市吉隆縣15拉薩藏山羊LS3658西藏自治區拉薩市9林周藏山羊LZ4200西藏自治區拉薩市林周縣9曲水藏山羊QS4200西藏自治區拉薩市曲水縣39薩嘎藏山羊SG4600西藏自治區日喀則市薩嘎縣8合計Total——157

1.2 試驗方法

1.2.1 序列擴增及測序 采用DNA提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit；北京)提取藏山羊血液基因組DNA。擴增Cytb全序列所用引物參照藏山羊mtDNA全序列(GenBank No.：KJ940969)設計(正向引物F1： 5′-AATAGGCGAAGGTTTTGAA-3′，反向引物R1：5′-GCTTTGGGTGCTGATAGTG-3′)，并由成都擎科生物公司合成。本研究中，PCR為30 μL反應體系：10×緩沖液15 μL，DNA(2.5 ng·μL-1)1 μL，正反向引物(10 pmol·μL-1)各1 μL，超純水12 μL。PCR擴增條件：94 ℃ 預變性5 min，35個循環(95 ℃ 30 s，55.3 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s)，72 ℃ 延伸10 min，之后于4 ℃保存。PCR產物在1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳及核酸檢測儀上檢測純度及濃度后，送至成都擎科生物有限公司進行測序。為確保序列的準確性，每條序列均經過正反雙向測定。

1.2.2 數據處理及分析 所有測得并經拼接的DNA序列用DNASTAR軟件中的SeqMan 5.01(DNAstar Inc；Madison. WI)程序排列同源序列，并進行人工校正。用DnaSP 5.0軟件[10]統計單倍型種類，計算核苷酸多樣度(Nucleotide diversity,Pi)和單倍型多樣性(Haplotypic diversity,Hd)。用MEGA 4.0 軟件[11]計算變異位點、簡約信息位點、遺傳距離等，構建系統發育鄰接樹(Neighbor-Joining，NJ)，以Bootstrap 1 000次重復抽樣檢驗分支置信度[12]。利用Network 4.6.1.0軟件[13]構建單倍型網絡圖，以直觀揭示單倍型之間的親緣關系以及基因流。Arlequin 3.5 軟件[14]計算群體間遺傳分化指數(FST)，并根據Nm≈(1-FST)/(2FST)計算群體間的基因流值；將種群進行群體劃分模式檢測，用分子變異分析方法(AMOVA)估測遺傳變異在種群內和種群間的分布、分化指數和對應的P值。

2 結 果

2.1 藏山羊的Cytb序列特征及遺傳多樣性

序列擴增及測序后經軟件比對并人工校正后得到157條全長1 140 bp的Cytb基因序列(圖略)，共檢測到33個變異位點，包含21個簡約信息位點和12個單堿基替換，其中錯義突變9個，無義突變24個，所有序列沒有出現插入或缺失的變異位點。基于此定義了30種單倍型(H1～H30)，其中CG(H1、H2)與 LS(H15、H16)為群體獨享單倍型。遺傳多樣性結果表明(表2)，LZ(Hd=0.722±0.097，Pi=0.001 8±0.000 6)與CG(Hd=0.625±0.093，Pi=0.001 8±0.000 4)的多樣性指數接近，且高于其他群體；JL多樣性指數(Hd=0.133±0.112，Pi=0.000 4±0.000 3)在8個群體中最低。但總的Hd(0.736±0.035)和Pi(0.001 8±0.000 2)值顯示出較高水平，表明所研究西藏地區的8個藏山羊群體具有較豐富的遺傳多樣性。

表2藏山羊群體間遺傳多樣性指數及中性檢驗值

Table2GeneticdiversityandneutralitytestsamongTibetangoatpopulations

群體Population單倍型種類及分布Haplotypesanddistribution單倍型多樣性(Hd)Haplotypediversity核苷酸多樣度(Pi)Nucleotidediversity中性檢驗NeutralitytestTaijima’sDFu’sFsCG7(H3、H8-H13)0.625±0.0930.0018±0.0004-0.828-0.353*DX2(H1、H2)0.476±0.1710.0004±0.00020.5590.589*HZL5(H3-H7)0.315±0.0910.0007±0.0002-1.111-0.851*JL2(H3、H13)0.133±0.1120.0004±0.0003-1.6850.834*LS2(H15、H16)0.222±0.1660.0008±0.0006-1.6101.844*LZ3(H3、H13、H17)0.722±0.0970.0018±0.00060.4971.855QS14(H3、H10、H11、H18-H28)0.682±0.0840.0017±0.0003-1.460-7.246**SG3(H3、H29、H30)0.464±0.2000.0010±0.0006-1.0300.506*合計Total30(H1-H30)0.736±0.0350.0018±0.0002-1.900*-22.020**

*. 0.01

2.2 藏山羊群體遺傳分化與基因交流

群體間遺傳分化指數(PairwiseFST)結果顯示(表3，下三角)，78.6 % 群體間的FST值達到了顯著水平(P<0.05)，表明大部分群體間(22/28，78.6%)發生了顯著或極顯著的遺傳分化。其中CG與LS間差異最大(FST=0.883 0，P<0.01)，表明兩組群體間的遺傳分化程度最高；反之DX和SG群體間分化程度最低(FST=0.032 9，P>0.05)。基因流參數值(Nm)區間為0.066 3～14.697 6(表3，上三角)，表明各群體之間的基因交流水平差異較大，其中CG、LS與其他群體間的基因交流受阻(Nm< 1)，表明群體間高度分離；SG和DX間基因交流較多(Nm>1)，群體分化程度低，與遺傳分化指數分析結果相符。AMOVA分析結果(FSC=0.392，P<0.001，表4 )表明，組內群體間遺傳分化差異極顯著，但變異來源所占比例較低，變異主要發生在種群內部，提示群體遺傳結構差異在縮小。整體群體間基因流Nm=0.776<1，表明藏山羊整體基因流水平較低，存在一定的遺傳分化。

表3藏山羊群體間的遺傳分化指數FST(下三角)和基因流值Nm(上三角)

Table3ThepairwiseFST(belowthediagonal)andgeneflowNm(abovethediagonal)amongtheTibetangoatpopulations

群體PopulationCGDXHZLJLLSLZQSSGCG0.12670.29570.07250.06630.27050.26420.1388DX0.7978**5.224812.06280.17572.23031.824714.6976HZL0.6284**0.0873**7.39390.38275.05313.721511.8548JL0.8734**0.03980.06330.12322.65841.59255.5416LS0.8830**0.7400**0.5665**0.8023**0.34520.31630.2159LZ0.6489**0.1831**0.0900*0.1583**0.5916**2.91534.8967QS0.6543**0.2151**0.1184**0.2390**0.6125**0.1464**2.7146SG0.7827**0.03290.04050.08280.6984**0.09270.1555**

表4藏山羊群體分子變異方差分析

Table4Analysisofmolecularvariance(AMOVA)ofTibetangoatpopulations

變異來源1Sourceofvariation1自由度df平方和Sumofsquares變異組成Variancecomponent變異比例/%Percentageofvariation分化指數2DifferentiationindexP值Pvalue組內Withingroup332.8300.11910.480.1050.175組內群體間Amongpopulationswithingroup424.9690.32628.720.321<0.001群體內Withinpopulation149102.7480.69060.800.392<0.001合計Total156160.5481.134

1.分組依據：來自同一個市區的樣本被分在同組。2.組內分化指數為FCT；組內群體間分化指數為FSC；群體間分化指數為FST

1. The samples from the same city are divided into one group.2.FCT,FSCandFSTrepresent differentiation indexes within group, among populations within group and within population, respectively

2.3 藏山羊的群體遺傳關系與系統發育

圖1是基于群體間遺傳距離構建的群體間NJ樹，結果顯示，DX與SG首先聚在一起，之后依次與HZL、QS、JL、LS、LZ、CG聚類。總體上看，CG與LS的遺傳關系最遠，DX與JL遺傳關系最近。另外，將NCBI下載的山羊Cytb4個單倍型組(Haplogroup A-D，登錄號：KP059202、KP059212、KP059220和KP059225)作為參考序列，構建了30種單倍型系統發育NJ樹(圖2)，藏山羊單倍型聚為4個支系，呈現出較強的譜系結構，不同地理來源的個體沒有完全形成各自的分支，而是混雜分布部分交錯，沒有形成明顯的地理分隔格局。其中，Haplogroup A 是主要單倍型組，由8個群體單倍型組成，其中LS、CG和JL的單倍型只在A系；Haplogroup B構成最簡單，只有1種單倍型(H17)；Haplogroup C 由來自QS和HZL的部分單倍型組成；Haplogroup D由HZL、QS、SG和DX的部分單倍型組成。

圖1 基于藏山羊群體間遺傳距離構建的親緣關系NJ樹Fig.1 An neighbor-joining (NJ) tree based on genetic distance of the Tibetan goat populations

圖2 藏山羊單倍型系統發育NJ樹Fig.2 An neighbor-joining (NJ) tree based on Tibetan goat haplotypes

2.4 藏山羊單倍型網絡關系

根據30種單倍型序列數據及其出現的頻率，繪制出藏山羊群體單倍型的中介網絡圖。圖3顯示，以H3為中心，呈星狀向周圍單倍型發散，表明群體可能發生過群體擴張；其次，H3與H18和H13連接，逐漸形成大大小小的網絡分支，推斷H3是主導單倍型，主要形成H3-H18和H3-H13的2個不重疊分布區的歷史基因流，通過擴散或基因交流，衍生出其余單倍型，分布于不同群體中；其中QS經過基因流的擴散，分布最廣。部分來自不同地區的群體的個體分享同種單倍型，但地理位置相同或相近的個體不完全聚類到同一個分支，表現了藏山羊群體地理關聯性較弱。

圖3 藏山羊單倍型中介網絡圖Fig.3 Network analysis of Tibetan goat haplotypes

2.5 中性檢驗與種群動態分析

中性檢驗值分析顯示(表2)，從單個地理群體看，JL、SG、LS的Tajima’sD和Fu’sFs值為一正一負，說明3個群體符合中性假說，沒有發生過群體擴張事件。DX、LZ 的2個值均為正，提示在歷史發展中，群體數量有過縮減；CG、HZL、QS的2個值均為負數，表明群體數量可能發生過急速擴增。從整體藏山羊種群來看，其中性檢驗結果均為負值(Tajima’sD=-1.900，P<0.05；Fu’sFs=-22.020，P<0.01)，且錯配分布曲線顯示為多峰現象(圖4)，表明藏山羊在歷史馴養過程中，可能因為部分種群的急速擴增而導致整體有種群擴增的跡象，曲線的多峰現象同時也驗證了部分群體數量的縮減事件。

3 討 論

3.1 藏山羊遺傳資源的保護

普遍認為，遺傳多樣性的高低反映了群體的環境適應能力和進化潛能[15]。本研究中，157只藏山羊共有30種單倍型，整體單倍型多樣性顯示出較高水平(0.736)，表明整個藏山羊群體較豐富的遺傳多樣性。但各群體的單倍型多樣性水平參差不齊，低至0.133，高達0.722，核苷酸多樣度均為較低水平，表明群體間多樣性水平差異較大，然而最高多樣性參數值(林周藏山羊群體LZ)低于中國家養山羊地方品種的平均水平[16-17]。此外，中性檢驗結果和錯配分析證明，在藏山羊歷史馴養過程中經歷過群體擴張事件，表明群體遺傳變異得到了積累，整體表現出較高的多樣性。然而值得注意的是，如果一個群體長期處于低水平的變異率或遺傳多樣性的狀態下，這將成為一個重要的瀕危信號[18]。吉隆縣位于西藏自治區西南部，是西藏同緯度地帶自然條件比較獨特的地區之一，自然生態環境結構復雜，交通相對閉塞，這些因素可能導致吉隆藏山羊群體(JL)與外部群體基因交流受限，有效群體數量逐漸縮小，處于多樣性快速丟失的過程中。因此，保護藏山羊群體的遺傳多樣性已刻不容緩。

圖4 基于Cytb基因分析藏山羊群體的錯配分布曲線Fig.4 Mismatch distribution curves of the Tibetan goats based on Cytb sequences

3.2 藏山羊群體的遺傳結構

FST值的大小反映了給定群體間的遺傳分化水平，0～0.05表示輕度分化，0.05～0.25表示中度分化，大于0.25表示重度分化。本研究中，8個群體間遺傳結構大部分有了明顯分化，但分化程度有所不同。AMOVA結果顯示了群體間極顯著的變異程度，但變異來源所占的比例較低，提示群體間的遺傳結構差異正在縮小。Nm值大小表明一個群體向另一個群體的基因流動，城關群體(CG)與拉薩群體(LS)的單倍型種類完全獨立，不與其他群體共享，且基因流值均小于1，表明城關地區和拉薩地區的藏山羊群體分離程度最高。這與我們之前基于mtDNA D-loop 序列所研究的藏山羊遺傳結構結果是相符的[19]。產生此結果的一個重要原因可能是，所研究群體的有效群體數量較低(如LZ、SG、CG等)，且生活在封閉的高山環境中，導致當地藏山羊與鄰近藏山羊群體之間的基因交流受限，進而長期保持低水平種群規模。由于有效群體數量的衰退，核苷酸替換數也極大可能被固定[20-21]。近年來，隨著山羊養殖業的迅速發展，牧民為了短期效益，盲目地引入外來品種與藏山羊進行無序雜交，進一步導致藏山羊優良基因逐漸丟失，多樣性降低，遺傳結構差異縮小，地理分隔格局變弱。結合J.C.Avise等[22]提出的親緣地理格局的模式分析藏山羊8個群體的遺傳結構，LS和CG符合“島嶼模型”，出現獨享單倍型；QS、DX、HZL、LZ、JL和SG地理屏障作用較小，使群體未彼此隔開，個體發生過相互遷移，有較多的基因交流。其中，當雄縣位于西藏自治區中部，為拉薩市的純牧業縣，加上現代畜牧科技(如人工授精技術)的利用與推廣，使得當雄產區的藏山羊與外群基因交流更為充分，群體間遺傳分化變弱。

3.3 藏山羊群體的多個母系起源

西藏卡若遺址出土的野生動物骨骼里發現了藏原羊的骨骼[23]，說明藏族先民馴養家羊的歷史可追溯至4 000年前的新石器時期。迄今為止，關于藏山羊起源的觀點并不一致。在以往的研究中，B. Fan等[24]分析了13個中國山羊品種的mtDNA D-loop序列多樣性，王杰等[3]利用微衛星標記分析了藏山羊群體系統發育關系，其結果均表明，藏山羊可能有多個母系起源；此外，蔡欣等[25]得到了不一致的結果，提出了藏山羊單個起源的觀點，可能是由于樣本采集地點、數目差異等因素導致。目前，對家養山羊的起源研究大部分是通過對mtDNA的研究將山羊大致分為了以下幾個單倍型組：Haplogroup A、B、C[26]、D[27]、F[28]和G[29]。M.B.Joshi等[30]命名了一個新的單倍型組(Haplogroup E)，但在加大樣本量研究后，Haplogroup E被認為是A的附系[31]，現今我國家養山羊共發現了4個支系[32]，在本研究中也證實了這點。本研究加入NCBI下載的4種Cytb單倍型作為參考序列構建藏山羊30個單倍型系統發育樹，形成4個主要的單倍型組(Haplogroup A-D)，其中Haplogroup A為主要單倍型組，Haplogroup B只由LZ一種單倍型構成，結果提示，藏山羊有4個母系起源，這與已發表的藏山羊起源研究的結果是一致的[19]，進一步支撐了藏山羊多個起源的假說。Haplogroup A廣泛分布于全世界家養山羊品種中，有報道稱Haplogroup B起源于中國[33]，Haplogroup C現在主要分布在歐洲地區，K.Nomura等[34]研究表明，Haplogroup D主要分布在亞洲南部和中部地區。本研究結果表明，藏山羊可能起源于歐亞大陸，有4個母系起源。此外，藏山羊個體沒有完全依據采樣區域形成獨立分支，而是呈現出地理上的融合，這一點在Haplogroup A中有明顯體現，8個群體中均有單倍型出現在Haplogroup A，Haplogroup C和D也有部分區域混合。Haplogroup B的構成單倍型最少，可能是因為樣本數不夠，需要更多的樣本支持。網絡圖中心單倍型H3的主要群體有DX和HZL，表明這2個群體古老單倍型保留得最多，分布最廣。此外，曲水地區的藏山羊群體傳播范圍廣，在進化上處于更近的時期。這樣的分布現況可能是多個母系祖先的影響、世代重疊、不同地理位置的群體混合，以及伴隨著基因漂變、自然選擇等原因導致[35]。

4 結 論

本研究表明，8個藏山羊群體總的遺傳多樣性水平較高，但群體間的遺傳多樣性水平不一，差距較大。各群體間大部分發生了明顯的遺傳分化，但沒有形成明顯的地理分隔格局；8個藏山羊群體分成了A、B、C、D 4個單倍型組，提示藏山羊有4個母系起源。

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