鐵蛋白Ferritin原核表達和純化及納米顆粒胞外自組裝

李志鵬，劉福航，崔奎青，石德順，劉慶友

(廣西大學,亞熱帶農業生物資源保護利用國家重點實驗室,南寧 530004)

鐵蛋白于1937 年由V.Laufberger[1]分離純化于馬的脾中，是生命活動所必需的蛋白之一。鐵蛋白是一個古老而龐大的蛋白家族，廣泛存在于動物、植物和微生物體內[2]。鐵蛋白本身在生命活動中的功能已經得到廣泛研究，如調節鐵元素的代謝平衡、抗氧化脅迫以及消除某些重金屬和有毒分子毒害等功能[3-6]。近年來，隨著納米技術的廣泛應用和對鐵蛋白結構的進一步認識, 鐵蛋白納米載體正成為腫瘤造影和藥物呈遞等生物醫藥領域的研究熱點[7-8]。天然合成的鐵蛋白主要由一個礦物質內核和一個蛋白外殼組成。蛋白外殼是一個由24個鐵蛋白亞基組成的球形空心納米籠狀結構，其中每3個亞基組成一個三聚體亞單位，8個三聚體亞單位再組裝成外徑12 nm，內徑8 nm的蛋白外殼[9]。1991年，英國巴斯大學F. C. Meldrum[10-11]實驗室首次在馬脾鐵蛋白的空腔內合成了磁性鐵核，這項工作開辟了納米顆粒仿生合成的新領域。2006年M.Uchida[12]實驗室利用原核表達系統重組表達人H-鐵蛋白，并在獲得的鐵蛋白外殼內仿生合成了磁性鐵蛋白。該方法簡化了鐵蛋白的仿生合成步驟，極大地推動了鐵蛋白在生物醫學領域的應用。鐵蛋白天然結構的物理性質穩定，能夠耐受高溫和多種變性劑[13-14]，但是對pH敏感。鐵蛋白外殼在pH 2.0 的酸性條件下解體，但在pH 恢復到生理條件(pH 7.0)時，又能重新組裝成天然結構的鐵蛋白[15-16]，利用這種特性人們可以對鐵蛋白納米結構的外表面、內表面或鐵內核進行選擇性的修飾。鐵蛋白外殼不僅可以通過化學方法進行修改，而且還可以進行基因工程修飾。2006年，美國新世紀醫藥公司(New Century Pharmaceuticals)在鐵蛋白L 亞基的N 端融合表達HIV 病毒的Tat 肽段，表達所得的蛋白具有鐵蛋白納米結構，并可以誘導產生高效的免疫應答[17]。2013年，NIH 過敏與傳染病研究所的疫苗研究中心又通過將流感病毒血凝素HA與幽門螺桿菌鐵蛋白亞基N端融合，用這種鐵蛋白免疫雪貂成功產生中和抗體。同時還發現，這種鐵蛋白疫苗顯著的增加了疫苗的廣譜性，且對動物內源鐵蛋白不產生免疫反應[18]。此后，鐵蛋白納米結構在抗原呈遞等醫藥相關研究中迅速升溫。韓國納米生物科學與化工學院利用鐵蛋白作為基于樹突狀細胞疫苗的抗原呈遞平臺[19]。Y.C.Chiu等[20]研究發現，鐵蛋白納米載體在抗原呈遞過程中可以通過改變抗原與免疫細胞的相互作用而增強免疫效果。

原核表達系統是目前研究最為成熟的表達系統，在外源蛋白表達領域得到了廣泛的應用[21]。本研究參考M.Kanekiyo等[18]使用的HelicobacterPylorinonheme iron-containing Ferritin 蛋白序列，并按照大腸桿菌密碼子偏好性進行密碼子優化，通過原核表達系統表達并純化得到重組Ferritin蛋白，為其作為納米載體在藥物與抗原呈遞中的研究和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

本試驗所用內切酶購自New England Biolabs (NEB)，配制緩沖液的試劑除特殊說明均為國產分析純。試驗所用克隆感受態細胞Trans 5α和表達感受態細胞BL21(DE3)均購自北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司。試驗所涉及到的引物合成及DNA測序均由上海生工生物工程有限公司完成。超螺旋DNA marker (Supercoiled DNA marker)購買自TaKaRa，DNA marker Ⅲ 購買自北京天根生化科技有限公司。

1.2 pET-32a-Ferritin原核表達載體構建

按大腸桿菌密碼子偏好性優化過的HelicobacterPylorinonheme iron-containing Ferritin 蛋白序列(WP_000949190.1)于上海生工生物工程有限公司合成并克隆于pMD-18T載體上。Ferritin全長502 bp，按照fast-fusion克隆試劑盒(FFPC-C020，GeneCopoeia)說明書在目的基因兩端設計同源臂，并在同源臂和目的基因之間添加酶切位點(表1，斜體下劃線處)。將Ferritin基因定向插入至pET-32a(+)載體多克隆位點區XhoI 和BamH I酶切位點之間，得到pET-32a-Ferritin原核表達載體(圖1)。提取菌液PCR陽性菌株的質粒(天根生化科技有限公司，北京)，用XhoI 和BamH I內切酶進行雙酶切鑒定，并送上海生工生物工程有限公司進行測序鑒定。

表1pET32a-Ferritin載體克隆引物

Table1PrimersofpET32a-Ferritinvectorforfast-fusion

名稱Name序列(5'→3')Sequence退火溫度/℃Tm擴增長度/bpProductlengthpET32a-FerritinFRTGGCTGATATCGGATCCATGCTGTCTAAAGACATCGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAGATTTACGAGATT60502

圖1 Ferritin原核表達載體構建Fig.1 Prokaryotic expression vector construction of Ferritin

1.3 Ferritin蛋白誘導表達

將鑒定后的陽性菌液按1∶50比例接種于10 mL LB 液體培養基中，37 ℃震蕩培養4 h，然后加入IPTG至終濃度0.5 mmol·L-1(保留1管菌液不加誘導劑以作陰性對照)，繼續誘導培養5 h。分別取1 mL菌液，4 ℃ 12 000 r·min-1離心2 min收集菌體，加入75 μL RIPA裂解液和25 μL 4×上樣緩沖液，混勻沸水煮10 min后，冰浴10 min。然后4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取上清，使用Bio-Rad Stain-Free試劑盒進行10% SDS-PAGE電泳。

1.4 Ferritin蛋白表達形式鑒定

收集100 mL陽性菌液，12 000 r·min-1離心5 min，用PBS洗滌2次后在沉淀中加入預冷的細菌裂解緩沖液(50 mmol·L-1Tris-HCl, 500 mmol·L-1NaCl, 0.1 mmol·L-1PMSF, 5 mmol·L-1EDTA, 1 mg·mL-1溶菌酶)，重懸菌體，冰上消化30 min。之后于冰浴中超聲波破碎菌體(400 W，2 s，2 s，30 min)，至菌液不再黏稠時即可停止。取50 μL菌液作為混合液樣品，另外取出1 mL菌液4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min。分別收取50 μL上清及沉淀制作可溶蛋白及包涵體樣品。分別取混合液，上清及沉淀使用Bio-Rad Stain-Free 試劑盒進行10% SDS-PAGE電泳。電泳結束后使用ChemiDoc?MP-Bio-Rad 凝膠成像系統進行拍照分析。然后用半干轉印法將蛋白轉移至硝酸纖維素膜。然后將硝酸纖維素膜用5% 脫脂牛奶(TBS-T配制)封閉2 h，之后用TBS-T洗滌3次，并用TBS清洗1次。然后加入His標簽一抗(1∶10 000，武漢三鷹)于4 ℃孵育過夜。次日再用TBS-T洗滌3次，TBS洗滌1次，然后用HRP標記的二抗于室溫孵育1 h。最后再用TBS-T洗滌3次，并用TBS清洗1次，用增強型ECL(15049A2，Millipore)顯色液進行顯色拍照。

1.5 His-Ferritin融合蛋白的親和層析

取pET-Ferritin陽性菌液300 mL，按照上述方法制作包涵體樣品，加入預冷的包涵體洗滌緩沖液，進行超聲洗滌(400 W，2 s，3 s，10 min)2次，之后4 ℃ 8 000 r·min-1離心10 min，收集包涵體，加入結合緩沖液冰上溶解。溶解后的包涵體經離心，過濾之后使用His-Trap HP層析柱及AKTA avant儀器進行親和層析，咪唑線性濃度梯度進行洗脫(咪唑濃度從20 mmol·L-1線性上升至500 mmol·L-1)，收集各段洗脫液進行SDS-PAGE電泳，分析融合蛋白His-Ferritin的純度。

1.6 蛋白的復性和組裝

由于將變性蛋白直接透析至不含尿素的緩沖液時，蛋白質很容易析出沉淀，而透析至含有2 mol·L-1脲的相同緩沖液中無沉淀產生[22]。因此將純化后的His-Ferritin 蛋白使用Hiprep 26/10(GE healthcare)脫鹽柱梯度置換至2 mol·L-1脲的復性緩沖液(2 mol·L-1尿素，50 mmol·L-1PBS，pH 8.0)，并于4 ℃放置過夜。然后將蛋白置換至50 mmol·L-1PBS，pH 8.0 緩沖液，4 ℃存放。復性后的蛋白用superdex 75 分子篩檢測蛋白復性效果。

1.7 His-Ferritin融合蛋白納米結構電鏡觀察

取10 μL復性后的蛋白質滴加到干凈塑料紙上制作微滴，將150 目銅網支持膜貼在液滴上吸附3～5 min，用濾紙吸去多余的樣品，然后滴加蒸餾水清洗銅網表面并用濾紙吸去多余液體。最后將銅網放置在2%磷鎢酸液滴中進行染色2 min，用濾紙吸去多余染色液后晾干銅網，使用日立HT7700 透射電子顯微鏡觀察。

2 結 果

2.1 pET-32a-Ferritin原核表達載體構建

通過同源重組連接得到大小為6 402 bp的pET-32a-Ferritin重組表達載體，對重組原核表達質粒進行雙酶切(BamH I+XhoI)鑒定，可見約502 bp的Ferritin片段及5 900 bp的載體片段(圖2)，大小均與理論值相同。

M1. 超螺旋 DNA相對分子質量標準; 1. pET-32a-Ferritin 質粒；2. pET-32a-Ferritin酶切后片段；M2. DNA相對分子質量標準M1. Supercoiled DNA marker; 1. pET-32a-Ferritin plasmid；2. pET-32a-Ferritin enzymatic digestion fragment；M2. DNA marker Ⅲ圖2 重組質粒pET-32a-Ferritin的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of pET-32a-Ferritin by double enzyme digestion

2.2 His-Ferritin融合蛋白誘導表達及表達形式

重組原核表達質粒pET-32a-His-Ferritin 共編碼332個氨基酸(包括His標簽等表達元件在內)，理論大小約為36.9 ku。10% SDS-PAGE電泳及Western-blot分析顯示，IPTG誘導后有一個約為37 ku蛋白出現過表達(圖3A)。使用His標簽抗體進行Western-blot 試驗，結果顯示，約在37 ku處有一條特異性條帶，表明誘導出的蛋白確為His-Ferritin融合蛋白(圖3B)。同時，可溶性分析結果顯示，His-Ferritin融合蛋白主要以包涵體形式表達。

2.3 His-Ferritin融合蛋白的親和層析純化及SDS-PAGE分析

選用His-Trap HP 層析柱對變性蛋白質進行親和層析純化，使用96孔深孔板對梯度洗脫過程中的洗脫產物進行完全收集，并選擇有代表性的樣品進行SDS-PAGE電泳分析。A1-E4對應96孔收集板不同的收集孔，分別對應不同濃度咪唑洗脫樣品(96孔板豎排標記A～E，橫排標記1～12)。結果顯示，咪唑線性梯度洗脫可以特異性的獲得目標蛋白，融合蛋白在咪唑濃度為190 mmol·L-1時出現單一洗脫峰(圖4A)。用SDS-PAGE 對穿透峰及不同濃度咪唑的洗脫產物進行SDS-PAGE分析，結果顯示，目的蛋白主要存在于洗脫峰處的洗脫液中，純度達96%(圖4B)。在洗脫峰處可見約37 和105 ku的2條蛋白條帶，說明在純化過程中有少量目標蛋白復性自組裝為三聚體結構。

A. SDS-PAGE膠驗證重組蛋白表達；B. Western-blot 驗證重組蛋白表達。M. 蛋白質相對分子質量標準；1. 未誘導的大腸桿菌總蛋白；2. IPTG誘導大腸桿菌總蛋白；3. IPTG誘導表達大腸桿菌總蛋白可溶組分；4. IPTG誘導表達大腸桿菌包涵體組分A. SDS-PAGE verifying the expression of His-Ferritin；B. Western-blot verifying the expression of His-Ferritin. M. Protein marker；1. Total protein of E.coli without induction；2. Total protein of E.coli after IPTG induction；3. Soluble protein of E.coli after IPTG induction；4. Inclusion body of E.coli after IPTG induction圖3 His-Ferritin融合蛋白誘導表達及表達形式分析Fig.3 Expression of His-Ferritin fusion protein and soluble analysis

M. 蛋白質相對分子質量標準; S. 重組蛋白樣品；A1～E4. 不同濃度咪唑洗脫樣品M. Protein marker；S. Recombinant protein sample；A1-E4. Imidazole elution samples with different concentrations圖4 His-Ferritin融合蛋白的親和層析純化(A)及SDS-PAGE分析(B)Fig.4 Affinity chromatography purification(A) and SDS-PAGE analysis (B) of fusion protein His-Ferritin

2.4 重組蛋白復性及胞外自組裝

為使純化得到的蛋白進行充分的復性及自組裝，將純化后的His-Ferritin 蛋白梯度置換至2 mol·L-1尿素的復性緩沖液放置于4 ℃ 過夜，Superdex75 檢測發現融合蛋白在外水體積出峰，說明大多數蛋白呈現為大分子量復合體，即在體外完成復性及自組裝(圖5A)。采用透射電子顯微鏡觀察復性后的蛋白質樣品，發現蛋白質呈現為均勻的納米級顆粒，粒徑約為12～20 nm(圖5B)。

A. 重組蛋白分子量和純度分析；B. 透射電鏡分析重組蛋白納米結構A. Molecular weight and purity analysis of recombinant protein；B. Transmission electron microscope analysis of nano-structure of recombinant protein圖5 重組蛋白復性與胞外自組裝Fig.5 Refolding and self-assembling in vitro of recombinant protein

3 討 論

生物納米技術的眾多優勢使其在生物醫藥領域得到了廣泛的關注。高小龍等[23]利用原核表達系統等篩選得到了新城疫病毒F蛋白納米抗體。鐵蛋白廣泛存在于生物體內，具有良好的生物安全性，其獨特的理化性質使其成為理想的納米載體，目前已廣泛用于腫瘤檢測與靶向治療以及多種癌癥預后指標[24-26]。T.R.Daniels等[25]研究發現，人鐵蛋白重鏈受體(TfR1)在腫瘤細胞中的表達量提高了100 倍，因此鐵蛋白納米顆粒可以作為腫瘤標志分子，并通過修飾攜帶藥物以TfR1為靶標，從而達到靶向治療的效果。許婉芳等[27]利用原核表達系統得到了重組人鐵蛋白，為其在生物醫學的應用提供基礎。此外，由于鐵蛋白內核Fe3O4具有超順磁性，使其可以發展為MRI 顯影劑。有學者甚至研究通過使體內的腫瘤細胞過表達H-鐵蛋白，并直接應用核磁共振實現體內腫瘤成像和淋巴結腫瘤轉移的檢測[7,28]。然而, 人們對于鐵蛋白與腫瘤關系的認識, 目前多是源于發現有鐵蛋白在腫瘤細胞中出現異常表達，其在腫瘤形成過程中的具體功能和機制還有待進一步研究。同時，由于鐵蛋白在免疫調控和炎癥發生等多方面均有著重要的作用，目前還無法確定體內直接過表達鐵蛋白的安全性。而且由于鐵蛋白在各組織器官中廣泛表達，過表達的鐵蛋白信號容易受到內源性鐵蛋白背景信號的干擾，從而不易于獲得明確的檢測信號。因此，使用外源鐵蛋白作為疾病診斷和治療的研究近年來成為一種趨勢。M.Kanekiyo等[18]研究表明，使用幽門螺桿菌鐵蛋白與流感病毒血凝素HA融合表達免疫動物后不會引起機體內源性蛋白的免疫反應。本研究通過原核表達獲得了與人類鐵蛋白H鏈同源性為46%的幽門螺桿菌的鐵蛋白，純化及復性過程中采用將Ferritin蛋白先變性純化，然后透析至2 mol·L-1脲復性，再透析至PBS的方案，降低目標蛋白形成不規則多聚體的幾率，使目標蛋白可以正確折疊為納米粒子，由于該蛋白為外源蛋白，作為納米載體應用于體內時理論上不會引起免疫系統針對自身鐵蛋白的免疫反應，更加有利于鐵蛋白納米粒子在醫學上的應用。

對蛋白類藥物而言，相對于化學修飾，采用基因工程方法將目標蛋白與鐵蛋白亞基融合表達的方法解決了在化學標記時標記蛋白方向的隨機性降低檢測靈敏度的問題。而通過將標記蛋白與鐵蛋白亞基融合表達，使融合蛋白有序的展示在鐵蛋白殼的外表面，提高抗體或藥物等目標蛋白的載量和效率。中國科學院生物物理研究所開發的攜帶阿霉素的H-鐵蛋白，通過單次注射即可特異性結合并殺死癌細胞[29]。在鐵蛋白L 亞基的N 端融合表達HIV 病毒的Tat 肽段，并用自組裝納米疫苗口服免疫小鼠引起高效的免疫應答[17]。韓國蔚山國家科學技術研究所研究發現，鐵蛋白可以將OT-1和OT-2肽段成功的呈遞于樹突狀細胞，并在體內和體外都可以誘導T細胞抗原特異性因子CD4和CD8的增殖[19]。本研究所使用的鐵蛋白包涵體分離純化及胞外復性自組裝方法使鐵蛋白可以在體外自組裝為具有納米結構的鐵蛋白納米粒子，該方法同樣適用于其他蛋白與鐵蛋白進行融合表達的純化與胞外自組裝。

4 結 論

本研究通過原核表達系統成功表達并純化得到了具有天然納米結構的鐵蛋白，該鐵蛋白粒徑均一，結構穩定，可以通過化學修飾用于藥物呈遞載體，也可以通過與蛋白類藥物或抗原等融合表達，直接用于新型藥物或疫苗的研發，為鐵蛋白納米粒子在生物醫藥領域的研究與應用提供參考。

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