SOX5影響小鼠皮膚黑色素細(xì)胞MITF-M表達(dá)和黑色素生成

常露程，趙兵令，劉 穎，白 云，李經(jīng)緯，李莉鑫，王海東

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801)

SOX基因家族是擁有一個或多個高遷移率組轉(zhuǎn)錄因子SRY相關(guān)的HMG盒，參與神經(jīng)調(diào)節(jié)、骨組織的發(fā)育等多種早期胚胎發(fā)育過程[1]。SOX家族根據(jù)HMG的保守程度又分為8組：A～H組，而SRY sex determining region Y-box 5 (SOX5)是SOXD中的一個基因[2]。SOX5在軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、以及黑色素細(xì)胞中都有重要的調(diào)節(jié)作用[3-5]，在黑色素瘤細(xì)胞中SOX5通過調(diào)節(jié)小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Microphthalmia-associated transcription factor，MITF)來調(diào)控黑色素瘤細(xì)胞的增殖[6]。MITF與轉(zhuǎn)錄因子EB、TFE3和TFEG一起構(gòu)成了MIT家族[7]，而MITF是MIT家族中唯一對正常黑色素細(xì)胞發(fā)育有重要作用的因子[8]。MITF基因是多啟動子結(jié)構(gòu)，至少有9種不同的啟動子-外顯子單元指導(dǎo)MITF的啟動[9]，而只有M啟動子(MITF-M)在黑素細(xì)胞中選擇性表達(dá)[10]。MITF-M是黑色素細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)因子，在黑色素瘤和色素沉著過度疾病中具有關(guān)鍵作用[11-13]。MITF-M直接調(diào)控相關(guān)色素基因的轉(zhuǎn)錄，包括酪氨酸酶(Tyrosinase，TYR)[14]、酪氨酸酶相關(guān)蛋白(Tyrosinase-related protein 1,TYRP1)[15]、Tyrosinase-related protein 2 (TYRP2)、前黑素體蛋白(Premelanosome protein，PMEL-17)[16](也稱PMEL)和Ocular albanism 1 (OA1)[17-18]等。TYR、TYRP1和TYRP2 3種主要色素沉著相關(guān)酶被認(rèn)為是MITF轉(zhuǎn)錄的靶基因且已被人所熟知[7,19]。PMEL依賴性MITF表達(dá)，其蛋白質(zhì)和mRNA水平受MITF的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[16,20]。并且PMEL是負(fù)責(zé)在黑素體內(nèi)色素細(xì)胞功能所必需，缺乏或突變PMEL表達(dá)的動物均顯示不同程度的色素沉著不足[21]。T.Z.Chen等[22]提出OA1可能通過調(diào)節(jié)MITF的水平以及黑素體的數(shù)量、大小、能動性和成熟，參與毛色的形成。OA1在調(diào)節(jié)MITF表達(dá)中的作用參與α-MSH-MITF信號傳導(dǎo)途徑[23]，并且OA1功能的喪失將大大降低MITF的表達(dá)，盡管其水平仍足以維持色素細(xì)胞的存活和分化狀態(tài)[24]。SOX5在不同毛色小鼠皮膚中定位以及表達(dá)是否存在一定的線性關(guān)系從而參與毛色的形成，以及在小鼠黑色素細(xì)胞中SOX5是如何調(diào)控黑色素的合成，目前未見相關(guān)報道。通過不同的生物學(xué)方法對SOX5進(jìn)行檢測，從而確定SOX5與毛色形成的相關(guān)性以及為研究SOX5調(diào)控黑色素合成路徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

MELM(2201) (SCIENCELL)、SOX5、TYR、TYRP1和TYRP2兔抗多克隆抗體(Abcam公司)、MITF兔抗多克隆抗體(武漢三鷹公司)、OA1兔抗多克隆抗體(Santa公司)、X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent(上海宇博生物公司)、C57BL/6品系小鼠、C57BL/6小鼠黑色素細(xì)胞5代、慢病毒載體pLV.Des3d.P/Puro(本實驗室提供)。

小鼠品系為C57BL/6，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)國家級動物醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)示范中心動物室提供，隨機(jī)選取出生后12 d的黑色、棕色、灰色小鼠各3 只，背部刮毛每只小鼠各取3塊皮膚組織，其中2塊組織用于總蛋白質(zhì)及總RNA的提取。其余1 塊在Bouin’s液中固定，用于小鼠皮膚毛囊組織切片制作。

1.2 RNA提取和qRT-PCR檢測

Trizol法提取不同毛色小鼠皮膚和每組細(xì)胞的總RNA，測定其濃度后反轉(zhuǎn)錄。在NCBI上檢索小鼠SOX5、MITF-M、TYR、TYRP1、TYRP2、PMEL、OA1序列，利用Premier 5.0軟件設(shè)計PCR擴(kuò)增引物，送北京華大基因公司合成。引物序列和產(chǎn)物長度見表1，退火溫度為58 ℃。

按照SYBR?Premix Ex TapTMⅡ試劑盒說明書進(jìn)行熒光定量PCR，通過2-ΔΔCT法計算目的mRNA相對表達(dá)量變化。

1.3 蛋白提取和Western blotting檢測

根據(jù)碧云天裂解液試劑盒說明書提取不同毛色小鼠皮膚組織和各組黑色素細(xì)胞的總蛋白，每個樣品總蛋白上樣量為200 μg，待SDS-PAGE電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)移至NC膜；NC膜經(jīng)5 %脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入SOX5(1∶500)，MITF、TYR、TYRP1、TYRP2(1∶1 000)，OA1(1∶400)以及β-Actin(1∶2 000)一抗4 ℃過夜孵育；次日NC膜用TBST搖洗3次(每次10 min)；加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶10 000)37 ℃恒溫水平搖床孵育NC膜1 h。NC膜用TBST搖洗6次(每次5 min)，使用ECL試劑盒顯色后進(jìn)行膠片曝光，掃描獲取目的圖像，用Image-ProPlus 6.0軟件對目的基因和β-actin免疫印跡結(jié)果進(jìn)行分析。蛋白含量=條帶面積×平均灰度；目的蛋白半定量值=目的蛋白含量/β-actin蛋白含量。

表1目的基因引物序列及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

Table1SequenceofprimerandproductssizeofPCR

1.4 免疫熒光檢測

將石蠟組織切片經(jīng)梯度酒精復(fù)水，滴加3% H2O2室溫靜置(10 min)，PBS搖洗3次(每次3 min)；滴加5%山羊血清，室溫封閉10 min，棄掉切片上的血清，并滴加1∶50倍SOX5兔抗多克隆抗體，陰性對照滴加抗體稀釋液；4 ℃過夜；次日37 ℃復(fù)溫30 min，用PBS搖洗2 次(每次3 min)；滴加1∶200倍FITC標(biāo)記羊抗兔IgG，放入37 ℃溫箱孵育30 min，用PBS搖洗4 次(每次5 min)；梯度脫水，水溶性封片劑封片、熒光顯微鏡下觀察。

1.5 小鼠SOX5、MITF-M克隆載體和真核表達(dá)載體構(gòu)建

1.5.1 克隆載體構(gòu)建 首先，Enzyme Solution 5 μL；目的基因PCR膠回收產(chǎn)物4 μL；T-Vector pMD19 1 μL。16 ℃連接14～16 h；隨后轉(zhuǎn)化、涂板；次日進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，37 ℃水平搖床200 r·min-1培養(yǎng)12～16 h，提取質(zhì)粒后,送華大基因公司測序，確定克隆載體是否構(gòu)建成功。

1.5.2 真核表達(dá)載體構(gòu)建 克隆載體雙酶切，回收的目的基因產(chǎn)物5 μL；表達(dá)載體產(chǎn)物4 μL；T4 DNA Ligase 1 μL。混勻，PCR儀中16 ℃過夜連接；其余操作同1.5.1。

1.6 黑色素細(xì)胞復(fù)蘇、轉(zhuǎn)染以及黑色素含量測定

小鼠黑色素細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)融合到75%～80%時進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。首先，將200 μL(無血清雙抗)培養(yǎng)基稀釋7.5 μL轉(zhuǎn)染試劑，混勻后室溫靜置5 min。其次，將5.0 μg DNA組加入混合液中，混勻后室溫靜置15 min。最后，將混合物滴加到含有1 mL新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)板(6 孔板)中，每孔補至2 mL，37 ℃培養(yǎng)48～56 h。

每組黑色素細(xì)胞用0.25%胰酶消化后收集，PBS沖洗2～3次，細(xì)胞計數(shù)后，用0.2 mol·L-1NaOH溶解黑色素細(xì)胞，85 ℃ 5 min充分溶解黑色素顆粒，475 nm波長下進(jìn)行吸光值檢測，每組至少重復(fù)3次。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)”表示，所有圖柱均用GraphPad PrismTM(GraphPad Software,Inc.California,USA)處理。

2 結(jié) 果

2.1 SOX5在不同毛色小鼠皮膚中定位

免疫熒光結(jié)果顯示，在不同毛色小鼠皮膚中均有SOX5蛋白的表達(dá)，且其主要表達(dá)部位為毛囊外根鞘，黑色和灰色小鼠皮膚中熒光強(qiáng)度明顯高于棕色小鼠皮膚(圖1)。由此可以看出，SOX5可以在不同毛色小鼠皮膚定位和表達(dá)。

a、b、c.黑、灰、棕小鼠皮膚SOX5陽性組； a-、b-、c-.黑、灰、棕小鼠皮膚SOX5陰性對照組；1.外根鞘；2.內(nèi)根鞘a, b, c.Black, gray, brown mice skin SOX5 positive groups; a-, b-, c-.Black, gray, brown mice skin SOX5 negative control groups; 1.Outer root sheath; 2. Inner root sheath圖1 不同毛色小鼠皮膚組織中 SOX5的免疫熒光圖Fig.1 Immunofluorescence results of SOX5 in mouse skin tissues with different coat colors

2.2 SOX5在不同毛色小鼠皮膚中表達(dá)

1%瓊脂糖凝膠電泳后顯示，SOX5條帶清晰且單一，條帶大小為157 bp (圖2A)。切膠后送華大基因公司測序，序列比對后正確，表明SOX5在不同毛色小鼠皮膚中可正常表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果表明：SOX5在黑色和灰色小鼠皮膚中mRNA相對表達(dá)量是棕色的8.12倍(P<0.01)和2.87倍(P<0.01)

(圖2B)。蛋白免疫印跡結(jié)果表明：在不同毛色小鼠皮膚的總蛋白可以與SOX5抗體發(fā)生免疫學(xué)陽性反應(yīng)(圖2C)，通過對蛋白條帶分析可知，SOX5在黑色和灰色小鼠皮膚中蛋白水平是棕色的2.46倍(P<0.01)和1.91倍(P<0.01) (圖2D)。由此可以看出，SOX5在不同毛色小鼠皮膚中表達(dá)量存在差異性，說明SOX5對毛色的形成有一定影響。

**.P<0.01。下同。A.不同毛色小鼠皮膚SOX5 PCR產(chǎn)物，M.DL2000 DNA marker; B.不同毛色小鼠皮膚SOX5的qRT-PCR分析結(jié)果；C.SOX5在不同毛色小鼠皮膚的蛋白印跡；D.SOX5在不同毛色小鼠皮膚中蛋白相對水平**.P<0.01. The same as below.A.SOX5 PCR products in different colors of mouse skin; M.DL2000 DNA marker;B. qRT-PCR analysis of SOX5 in different colors of mouse skin; C.Immunoblot results of SOX5 protein in different colors of mouse skin;D.Relative expression level of SOX5 protein in different colors of mouse skin圖2 不同毛色小鼠皮膚中SOX5表達(dá)量分析Fig.2 Analysis of the expression of SOX5 in different colors of mouse skin

2.3 小鼠SOX5與MITF-M核酸序列獲取和真核表達(dá)載體構(gòu)建

在NCBI中獲取SOX5和MITF-M的CDS區(qū)，成功構(gòu)建真核表達(dá)載體。為確保載體連接的準(zhǔn)確性，提取質(zhì)粒進(jìn)行了測序。在NCBI對測序結(jié)果進(jìn)行比對，序列為小鼠SOX5和MITF-M的CDS區(qū)，大小為2 292和1 260 bp(圖略)，與SOX5和MITF-M序列完全一致。

2.4 過表達(dá)SOX5后黑色素細(xì)胞的形態(tài)特征

小鼠黑色素細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)融合到75%～80%時，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，此時細(xì)胞密集且無其它細(xì)胞污染。空載組(Vector-GFP)、試驗組(Vector-GFP-SOX5)與正常組(Control)相比形態(tài)未發(fā)生明顯改變 (圖3)。

Control.正常黑色素細(xì)胞；Vector-GFP.轉(zhuǎn)染空載體的黑色素細(xì)胞；Vector- GFP-SOX5.轉(zhuǎn)染SOX5的黑色素細(xì)胞。下同Control.Normal melanocytes;Vector-GFP.The melanocytes transfected with empty vector;Vector-GFP-SOX5.The melanocytes transfected with SOX5.The same as below 圖3 SOX5轉(zhuǎn)染后黑色素細(xì)胞的形態(tài)Fig.3 Morphology of melanocytes transfected by the SOX5

2.5 黑色素細(xì)胞中SOX5的轉(zhuǎn)染效率

過表達(dá)SOX5后經(jīng)檢測空載組(Vector-GFP)與正常組(Control)中SOX5表達(dá)量無顯著差異，試驗組(Vector-GFP-SOX5)中SOX5 mRNA升高18.80倍 (P<0.01) (圖4A); 蛋白升高1.69倍 (P<0.05)(圖4B,C)。

2.6 SOX5與MITF-M表達(dá)的相互影響

過表達(dá)SOX5后結(jié)果顯示：與空載組(Vector-GFP)對比，試驗組(Vector-GFP-SOX5)的MITF-MmRNA升高1.50倍(P<0.05) (圖5A)；蛋白升高1.95倍(P<0.01) (圖5B,C)。為了進(jìn)一步說明SOX5與MITF-M的關(guān)系，過表達(dá)MITF-M后使SOX5的mRNA降低1.34倍(P<0.05)(圖5D)；蛋白降低2.05倍(P<0.05)(圖5E,F)。表明，過表達(dá)SOX5促進(jìn)MITF-M的表達(dá)，而過表達(dá)MITF-M抑制SOX5的表達(dá)。

2.7 SOX5對黑色素細(xì)胞色素生成基因及色素含量的影響

過表達(dá)SOX5后結(jié)果顯示：與空載組(Vector-GFP)對比，試驗組(Vector-GFP-SOX5)的TYRmRNA升高3.13倍(P<0.01)，蛋白升高1.43倍(P<0.05)；TYRP1 mRNA升高3.41倍(P<0.01)，蛋白升高1.56倍(P<0.05)；TYRP2 mRNA升高1.31倍(P<0.05)，蛋白升高1.20倍(P<0.05) (圖6A,B,C)。通過檢測黑色素含量可知空載組(Vector-GFP)與正常組(Control)無顯著差異，試驗組(Vector-GFP-SOX5)黑色素含量明顯增加，相對于空載組黑色素含量增加1.47倍(P<0.01)(圖6D)。表明，SOX5表達(dá)量的變化對黑色素的合成有影響。

*.P<0.05。1.Vector-GFP;2.Vector-GFP-SOX5。下同。A. SOX5 mRNA的表達(dá)差異；B.蛋白陽性免疫印跡；C.蛋白相對水平分析*.P<0.05.1.Vector-GFP;2.Vector-GFP-SOX5.The same as below.A. SOX5 mRNA expression in melanocytes transfected with Vector-GFP-SOX5; B.The positively blotting signal in melanocytes transfected with Vector-GFP-SOX5; C. Relative level of SOX5 protein in melanocytes transfected with Vector-GFP-SOX5圖4 SOX 5轉(zhuǎn)染后黑色素細(xì)胞中SOX 5 mRNA和蛋白水平Fig.4 SOX5 mRNA and protein levels in melanocytes transfected by the SOX5

1.Vector-GFP; 2.Vector-GFP-SOX5; 3.Vector-GFP-MITF-M。A、D.MITF-M和SOX5 mRNA的表達(dá)差異；B、E.MITF-M和SOX5蛋白陽性免疫印跡；C、F.MITF-M和SOX5蛋白相對水平分析1.Vector-GFP;2.Vector-GFP-SOX5;3.Vector-GFP-MITF-M.A,D.MITF-M and SOX5 mRNA expression in melanocytes transfected with Vector-GFP-SOX5 and Vector-GFP-MITF-M; B,E.The positively blotting signal in melanocytes transfected with Vector-GFP-SOX5 and GFP-MITF-M; C,F.Relative level of MITF-M and SOX5 proteins in melanocytes transfected with Vector-GFP-SOX5 and Vector-GFP-MITF-M圖5 檢測轉(zhuǎn)染后黑色素細(xì)胞中SOX5和MITF-M的表達(dá)Fig.5 Analysis of SOX5 and MITF-M expression in melanocytes after transfection

A.TYR、TYRP1、TYRP2 mRNA的表達(dá)差異; B.蛋白陽性免疫印跡; C.TYR、TYRP1和TYRP2蛋白相對水平分析; D.黑色素含量分析A.TYR,TYRP1 and TYRP2 mRNA expression in melanocytes transfected with Vector-GFP-SOX5; B.The positively blotting signal in melanocytes transfected with Vector-GFP-SOX5; C.Relative levels of TYR,TYRP1 and TYRP2 protein in melanocytes transfected with Vector-GFP-SOX5; D.Melanin content analysis in Control, Vector-GFP and Vector-GFP-SOX5圖6 SOX5對黑色素生成的影響Fig.6 Effect of SOX5 on melanin formation

2.8 SOX5對PMEL和OA1的影響

過表達(dá)SOX5后結(jié)果顯示：與空載組(Vector-GFP)對比，試驗組(Vector-GFP-SOX5)的PMELmRNA升高4.8倍(P<0.01) (圖7A)(PMEL不屬于主線基因加上經(jīng)費原因，沒有進(jìn)行相關(guān)蛋白分析)；OA1 mRNA升高2.1倍(P<0.05)，OA1蛋白升高1.29倍(P<0.05) (圖7B,C,D)。由此可以看出，過表達(dá)SOX5可以使PMEL和OA1的表達(dá)升高。

A、B. PMEL和OA1 mRNA的表達(dá)差異; C.OA1蛋白陽性免疫印跡; D. OA1蛋白相對水平分析A,B.PMEL and OA1 mRNA expression in melanocytes transfected with Vector-GFP-SOX5;C.The positively blotting signal of OA1 in melanocytes transfected with Vector-GFP-SOX5;D.Relative level of OA1 protein in melanocytes transfected with Vector-GFP-SOX5圖7 SOX5對PMEL和OA1的影響Fig.7 Effect of SOX5 on PMEL and OA1

3 討 論

哺乳動物背毛顏色的多樣性取決于黑色素中的真黑素(棕色/黑色)和褐黑素(黃色/紅色)的相對含量[25]。P.C.Wang等[26]在黑色素細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)microRNA-21a-5p在調(diào)節(jié)黑色素生成的功能中是通過靶向SOX5實現(xiàn)的。以及在人的黑色素瘤細(xì)胞中，SOX5通過MITF調(diào)節(jié)人黑素瘤細(xì)胞的平衡。本試驗探究SOX5在不同毛色小鼠皮膚表達(dá)量是否存在差異性，結(jié)果表明，SOX5在不同毛色小鼠皮膚表達(dá)量不同，SOX5在黑色小鼠皮膚的表達(dá)量>灰色>棕色。本試驗結(jié)果為進(jìn)一步研究其對黑色素的生成以及如何參與毛色形成奠定了基礎(chǔ)。

本試驗通過過表達(dá)SOX5后明顯升高M(jìn)ITF-M的表達(dá)。與此不同的是T.Kordab等[6]發(fā)現(xiàn)的升高SOX5抑制了MITF的表達(dá)。兩者存在差異性可能由于SOX5過高或過低激活相應(yīng)的調(diào)控路徑對MITF-M表達(dá)產(chǎn)生不同的結(jié)果。為了進(jìn)一步了解SOX5與MITF-M關(guān)系，結(jié)果顯示過表達(dá)MITF-M對SOX5表達(dá)存在負(fù)反饋作用。由此可以看出，SOX5可以調(diào)控MITF-M表達(dá)進(jìn)而影響色素生成。黑素體是黑色素合成的場所[27]，黑素體蛋白PMEL發(fā)生在黑素體I期和Ⅱ期作為原纖維的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在斑馬魚視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞PMEL和OA1兩者均可調(diào)節(jié)黑素體數(shù)量、形狀以及能動性[28]，并且過表達(dá)OA1可以明顯升高PMEL[22]。本試驗過表達(dá)SOX5后，PMEL和 OA1表達(dá)量升高，由此可知，PMEL與 OA1受SOX5通過MITF-M來調(diào)節(jié)。本試驗通過過表達(dá)SOX5，使TYR、TYRP1以及TYRP2表達(dá)量升高，最終引起黑色素含量升高；與楊玉靜等[29]研究相吻合。由此可以得出，SOX5可以影響色素生成，進(jìn)而參與毛色的形成。

4 結(jié) 論

SOX5在不同毛色小鼠皮膚中的表達(dá)存在差異性，可以通過MITF-M調(diào)控色素相關(guān)基因來影響色素生成，并且MITF-M對SOX5有負(fù)調(diào)控作用，這為SOX5參與毛色形成潛在機(jī)制提供依據(jù)。

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