缺氧條件下巨噬細胞移動抑制因子對肉雞心肌脂肪酸代謝的影響

任 昊，李麗芳，王彥美，黃 楠，裴芳櫻，李嘉威，孫耀貴，段智變，李宏全，王文魁*

(1.山西農業大學動物科技學院，太谷 030801； 2.山西農業大學信息學院環境科學與食品工程系，太谷 030801；3.濱州學院生物工程學院，濱州 256600)

肉雞肺動脈高壓綜合征(pulmonary hypertension syndrome, PHS)，又稱腹水綜合征(ascites syndrome, AS)，作為嚴重影響肉雞養殖業的重要代謝性疾病，一直以來備受養雞從業者和科學研究者的高度重視。AS屬代謝綜合征，其發生發展涉及多因素、多層次、多環節，以往的研究主要集中于缺氧引起肺動脈高壓這一中心環節[1-4]，部分解釋了本病的發生發展過程，尚不能完全揭示其發病機制。右心肥大是該綜合征的顯著特征[5-6]，闡明右心肥大的發生發展，從另一視角審視肉雞腹水綜合征，無疑有利于全面揭示本病的發病機制。

心力衰竭及心臟肥大過程中腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated kinase, AMPK)激活，一方面，AMPK依賴性磷酸化6-磷酸果糖激酶被激活，促進糖酵解，生成更多ATP，滿足心肌能量代謝需求[7-8]；另一方面，AMPK通過激活脂肪酸轉位酶(fatty acid translocase, FAT/CD36)進而促進心肌攝取游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)，并通過磷酸化乙酰輔酶A抑制其向丙二酰輔酶A(malonyl-CoA)轉化，從而增強心肌對脂肪酸的利用[9-10]。筆者前期研究發現，AS患病肉雞心臟巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory, MIF)表達量顯著高于健康對照雞。哺乳動物研究資料提示，MIF在心肌缺血、缺氧等應激反應過程中通過激活AMPK參與心肌能量代謝調節，對心臟生理活動和病理變化具有重要作用[11-12]。為了確認MIF是否通過激活AMPK參與雞心肌細胞脂肪酸代謝調節，我們開展了此項研究。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

9～12日齡AA肉雞雞胚，購自山西康牧種雞場。

1.2 主要試劑

1.2.1 細胞培養用試劑 DMEM高糖培養基(SH30022.01，HyClone)、新生牛血清(16010-159，Gibco)、P/S雙抗青鏈霉素(PAA)、0.25%胰蛋白酶(25200-056，Sigma)、膠原酶Ⅱ(C8150，Solarbio)。氯化鈷(C8661，Sigma)、ISO-1(Ab142140，Abcam)。

1.2.2 免疫細胞化學試驗用試劑 4%多聚甲醛溶液(Solarbio)、Triton X-100(Solarbio)、α-Sarcomeric actin(BM0001，Boster)、SABC-POD(小鼠IgG)試劑盒(SA1021，Boster)、羊抗鼠IgG-HRP(Boster)、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(Solarbio)、DAB顯色試劑盒(AR1022，Boster)

1.2.3 蛋白質免疫印跡用試劑 除兔抗雞MIF多抗為實驗室自制外，其他均為商品化多克隆抗體：HIF-1α(D262108，BBI)、AMPK(bs-1115R，Bioss)、p-AMPK(2531，Cell Signaling)、FAT/CD36(D161529，BBI)、ACC(D155300，BBI)、p-ACC(D155180，BBI)、CPT-1A(bs-2047R，Bioss)。羊抗兔IgG-HRP二抗(Bioss)，RIPA裂解液(Beyotime)，4×蛋白質上樣緩沖液(Solarbio)。

1.3 方法

1.3.1 雞胚心肌細胞分離培養 根據P. Simpson等的方法適當改進[13]。取孵化9～12日齡肉雞蛋，用75%酒精消毒蛋殼后轉入超凈工作臺，進行無菌操作：取出雞胚，暴露胸腔，摘取心放入預冷的無鈣、鎂PBS緩沖液，吹打清洗，剔除心冠脂肪血管等組織； PBS緩沖液(無鈣、鎂)漂洗3次后剪成直徑約1 mm大小的組織塊，再用PBS緩沖液(無鈣、鎂)漂洗3次。加入0.08%胰蛋白酶溶液，37 ℃恒溫振蕩消化，大約5 min后棄上清液，再加0.125%胰蛋白酶與0.1% Ⅱ型膠原酶(等量混合)，37 ℃靜置消化8 min，加10%新生牛血清DMEM高糖液體培養液終止消化，如此重復消化數次，直至組織塊呈絮狀半透明樣為止。經200目篩網過濾，去除細胞團塊，常溫1 000 r·min-1離心8 min，棄上清，用完全培養基重懸，移入30 mm細胞培養皿，常規(37 ℃、5% CO2)培養40 min除成纖維細胞，再以1×106·mL-1接種于6孔培養板常規培養，并分別于18、42 h更換培養液。

1.3.2 心肌細胞形態機能觀察 細胞培養至24、48 h時，倒置顯微鏡下觀察心肌細胞生長情況及自主搏動頻率、強度，進行拍照、錄像。

1.3.3 免疫細胞化學鑒定 采用免疫細胞化學染色鑒定心肌細胞。將培養48 h的細胞爬片用預冷PBS清洗3次，4%多聚甲醛室溫固定細胞15 min，再用0.5% Triton X-100細胞通透劑處理30 min；接著按即用型SABC-POD試劑盒說明進行操作：10% H2O2阻斷內源性過氧化物酶，5% BSA封閉，一抗(1∶300)4 ℃濕盒孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，DAB顯色(黃)。稀釋液PBS作陰性對照。

1.3.4 心肌細胞化學性缺氧模型的建立 24 h培養良好的心肌細胞，換無血清DMEM高糖培養基饑餓培養8～12 h，細胞呈現同步化搏動時開始建模。試驗組給予不同濃度(400、500、600和700 μmol·L-1)氯化鈷，正常對照組加入無血清培養基，37 ℃、5% CO2培養24 h，摸索化學性缺氧最佳條件。

1.3.5 MIF阻斷試驗 在缺氧的同時，試驗組給予不同濃度(10、50和100 μmol·L-1)MIF阻斷劑(ISO-1)，正常對照組加入無血清培養基，37 ℃、5% CO2培養24 h，觀察ISO-1對MIF的阻斷效果。

2 結 果

2.1 原代雞胚心肌細胞形態學及機能活動觀察

剛分離消化的心肌細胞呈類圓形，懸浮于培養液中；培養24 h后細胞大分部貼壁，呈梭形、不規則形，立體感明顯且具較強折光性(圖1A)，細胞搏動明顯，但節律不一致，30～60次·min-1；48 h后心肌細胞伸出偽足相互接觸交聯成網狀(圖1B)，收縮明顯而有力，出現同步搏動，節律80～130次·min-1。

A.培養24 h；B.培養48 hA. Cardiomyocytes cultured for 24 hours；B. Cardiomyocytes cultured for 48 hours圖1 光鏡下原代雞胚心肌細胞(200×)Fig.1 Primary chicken embryonic cardiomyocytes in vivo (200×)

2.2 免疫細胞化學鑒定

免疫細胞化學染色結果顯示，陽性組心肌細胞核藍染，細胞質充滿細小均勻的棕黃色絲狀結構，心肌細胞占90%以上(圖2A)；陰性對照組以PBS替代一抗，細胞質內未見棕黃色肌絲結構(圖2B)。

2.3 心肌細胞缺氧模型的構建

Western blot檢測結果顯示(圖3、表1)，與正常組相比，600 μmol·L-1氯化鈷處理組HIF-1ɑ和MIF蛋白表達量極顯著升高(P<0.01)。

2.4 ISO-1阻斷MIF試驗

Western blot檢測結果顯示(圖4、表2)，與正常組相比，氯化鈷處理組MIF及p-AMPK蛋白表達量均極顯著升高(P<0.01)；與氯化鈷處理組相比，ISO-100 μmol·L-1阻斷組MIF及p-AMPK蛋白表達量均極顯著降低(P<0.01)。

A. 陽性染色組；B. 陰性對照組A. Positive staining group incubated with α-sarcomeric actin；B. Negative control with PBS圖2 原代雞胚心肌免疫細胞化學鑒定(400×)Fig.2 The chicken embryonic cardiomyocytes incubated with α-sarcomeric actin (400×)

0、400、500、600和700 μmol·L-1氯化鈷處理雞胚心肌細胞24 h HIF-1α及MIF的免疫印跡The chicken embryonic cardiomyocytes were treated with 0, 400, 500, 600 or 700 μmol·L-1 CoCl2 for 24 h, and the expression levels of HIF-1α and MIF were determined by Western blot圖3 氯化鈷處理的雞胚心肌細胞HIF-1α、MIF表達變化Fig.3 Effects of cobalt chloride on the expression of HIF-1α, MIF in the chicken embryonic cardiomyocytes

表1經氯化鈷處理雞胚心肌細胞HIF-1α、MIF表達量

Table1ExpressionofHIF-1αandMIFinthecardiomyocytestreatedwithCoCl2

目的蛋白質Targetprotein對照組Controlgroup氯化鈷組CoCl2group400μmol·L-1500μmol·L-1600μmol·L-1700μmol·L-1HIF-1α11.167±0.007*1.537±0.010**1.721±0.021**1.243±0.019*MIF11.235±0.0152.085±0.075**4.492±0.071**2.931±0.004**

與對照組相比，*.P<0.05；**.P<0.01

Compared with the control group,*.P<0.05;**.P<0.01

0、10、50和100 μmol·L-1 ISO-1處理雞胚心肌細胞24 h，MIF及p-AMPK免疫印跡The chicken embryonic cardiomyocytes were treated with 0, 10, 50 and 100 μmol·L-1 ISO-1 for 24 h, and the expression levels of MIF and p-AMPK were determined by Western blot圖4 ISO-1處理雞胚心肌細胞24 h后其MIF、p-AMPK表達變化Fig.4 Effects of ISO-1 on the expression of MIF and p-AMPK in the chicken embryonic cardiomyocytes

表2ISO-1處理雞胚心肌細胞MIF、p-AMPK表達量

Table2ExpressionofMIFandp-AMPKinthecardiomyocytestreatedwithISO-1

目的蛋白質Targetprotein對照組Controlgroup氯化鈷組CoCl2groupCoCl2+ISO組CoCl2+ISOgroupCoCl2+10μmol·L-1ISOCoCl2+50μmol·L-1ISOCoCl2+100μmol·L-1ISOMIF13.835±0.105**3.232±0.089#2.985±0.053##2.880±0.080##p-AMPK11.668±0.087**1.414±0.0041.208±0.055#1.083±0.083##

與對照組相比，*.P<0.05；**.P<0.01。與氯化鈷組相比，#.P<0.05;##.P<0.01

Compared with the control group,*.P<0.05;**.P<0.01. Compared with the CoCl2group,#.P<0.05;##.P<0.01

2.5 缺氧狀態下雞胚心肌細胞脂肪酸代謝途徑關鍵蛋白質的變化

HIF-1α、MIF、FAT/CD36和CPT-1A均以β-actin為內參，p-AMPK以AMPK和β-actin為內參，p-ACC以總ACC和β-actin為內參。Western blot檢測結果顯示(圖5、表3)，與對照組相比，缺氧組雞胚心肌細胞HIF-1α、MIF、FAT/CD36、CPT-1A及磷酸化p-AMPK和p-ACC表達量極顯著增多(P<0.01)。

圖5 缺氧狀態下雞胚心肌細胞HIF-1α、MIF、p-AMPK、FAT/CD36、p-ACC、CPT-1A表達的免疫印跡分析Fig.5 The Western blot analysis of HIF-1α、MIF、p-AMPK、FAT/CD36、p-ACC and CPT-1A in chicken embryonic cardiomyocytes in hypoxia

表3缺氧狀態下雞胚心肌細胞脂肪酸代謝途徑關鍵蛋白質的變化

Table3Theexpressionlevelsofthekeyproteinsoffattyacidmetabolicpathwayinchickenembryoniccardiomyocytesinhypoxia

目的蛋白質Targetprotein對照組Controlgroup氯化鈷組CoCl2groupHIF-1α0.993±0.0341.176±0.021**MIF1.000±0.0471.731±0.167**p-AMPK1.053±0.0491.753±0.104**FAT/CD361.057±0.0531.905±0.052**p-ACC1.140±0.1443.901±0.163**CPT-1A1.074±0.1222.844±0.253**

與對照組相比，*.P<0.05；**.P<0.01

Compared with the control group,*.P<0.05;**.P<0.01

2.6 阻斷MIF后各目的蛋白質在雞胚心肌中的表達變化

Western blot檢測結果顯示(圖6、表4)，與缺氧組相比，ISO-1阻斷組雞胚心肌細胞MIF、FAT/CD36、CPT-1A及磷酸化p-AMPK和p-ACC表達量極顯著降低(P<0.01)。

圖6 ISO-1處理后缺氧雞胚心肌細胞MIF、p-AMPK、FAT/CD36、p-ACC、CPT-1A表達的免疫印跡分析Fig.6 The Western blot analysis of MIF、p-AMPK、FAT/CD36、p-ACC and CPT-1A in chicken embryonic cardiomyocytes treated with ISO-1 in hypoxia

3 討 論

肉雞腹水綜合征這一代謝性疾病嚴重影響著養雞業的經濟效益和雞肉品質，目前認為缺氧是導致肉雞發生AS的主要原因[14-15]。肉雞生長快，心肺功能相對較弱，這是造成機體相對缺氧或絕對缺氧的先天因素；飼養管理不當、環境氣候變化、營養失調、罹患其他疾病等造成機體處于應激狀態，加劇缺氧，引起肺動脈重構，肺循環阻力增大，使處于“能量饑餓”的心臟，特別是右心，代償性肥大[16-17]。

為了探討缺氧對心肌能量代謝的影響，我們首先建立了肉雞雞胚心肌細胞缺氧模型。獲得高純度、高活力的雞胚心肌細胞是本研究的基礎。結果

表4ISO-1處理后缺氧雞胚心肌細胞脂肪酸代謝途徑關鍵蛋白質的變化

Table4TheexpressionlevelsofthekeyproteinsoffattyacidmetabolicpathwayinchickenembryoniccardiomyocytestreatedwithISO-1inhypoxia

目的蛋白質Targetprotein對照組Controlgroup氯化鈷組CoCl2group抑制劑組ISOgroupMIF1.005±0.0053.995±0.222**2.847±0.295##p-AMPK0.995±0.0052.361±0.124**1.446±0.034##FAT/CD360.830±0.1701.676±0.040**1.039±0.050##p-ACC0.885±0.1152.359±0.038**1.087±0.189##CPT-1A0.975±0.0253.760±0.090**2.605±0.045##

與對照組相比，*.P<0.05；**.P<0.01。與氯化鈷組相比，#.P<0.05;##.P<0.01

Compared with the control group,*.P<0.05;**.P<0.01. Compared with the CoCl2group,#.P<0.05;##.P<0.01

顯示(圖1、2)，免疫細胞化學鑒定及心肌特有功能(自律性搏動)均確認，采用含10%新生牛血清的高糖DMEM培養液培養雞胚心肌細胞獲得成功，其搏動頻率在80～130次·min-1。

氯化鈷作為一種化學缺氧模擬劑，其二價鈷通過競爭二價鐵抑制脯氨酸羥化酶的活性，提高HIF-1α的穩定性，促進HIF-1的轉錄活性，使常氧條件下低氧反應元件調控的基因得以轉錄表達[18-20]。筆者的研究結果顯示(圖3)，400～700 μmol·L-1CoCl2作用24 h時HIF-1α表達顯著增加，且二者在400～600 μmol·L-1CoCl2間呈正相關，CoCl2濃度再增大(700 μmol·L-1)時，HIF-1α表達量反下降。提示600 μmol·L-1CoCl2處理心肌細胞24 h，可獲得良好的體外培養細胞缺氧模型。

S. M. Welford等研究發現，HIF-1α能與MIF啟動子區域特異性低氧反應原件(HRE)結合，進而調控MIF的轉錄表達[21]。圖3表明，CoCl2濃度在400～700 μmol·L-1范圍內，雞胚心肌細胞HIF-1α和MIF的表達具有相同變化趨勢，在400～600 μmol·L-1間二者表達量逐漸增大，增至700 μmol·L-1時二者表達量均下降。這種高度擬合的變化趨勢充分佐證，雞MIF基因同樣具有低氧反應元件，其轉錄表達受HIF-1α調控。

AMPK作為細胞的“能量感受器”，在細胞能量代謝中扮演著“總開關”的作用[22-24]。心臟缺血再灌注損傷時引起心肌自分泌MIF，通過激活AMPK，改善其能量代謝[25-26]。我們前期研究發現[27]，AS患病肉雞心臟組織MIF、p-AMPK表達量均顯著高于正常肉雞，猜測缺氧時MIF、p-AMPK與腹水的發生有關。試驗結果顯示(圖4)，缺氧時心肌MIF表達增多、AMPK活化增強；ISO處理缺氧心肌細胞后，MIF表達減少、AMPK活化降低。這種現象提示：缺氧時雞心肌細胞自分泌MIF增多，后者通過激活AMPK調節心肌能量代謝。心肌主要依賴脂肪酸供能(占心肌總耗能的60%～90%)[28]，我們利用Western bolt檢測了缺氧雞胚心肌細胞脂肪酸代謝途徑關鍵蛋白的變化(圖5、6)，缺氧時FAT/CD36、磷酸化乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase, p-ACC)和肉毒堿棕櫚酰轉移酶1(carnitine palmitoyltransferase 1, CPT-1A)的蛋白質表達增加；ISO阻斷MIF后這三種蛋白表達均顯著降低。由此推斷，活化的AMPK一方面激活FAT/CD36，促進脂肪酸跨細胞膜向細胞內轉運；另一方面磷酸化ACC使其失活，從而阻止丙二酰輔酶A形成，解除丙二酰輔酶A對CPT-1A的抑制，加速脂酰輔酶A(fatty acyl-CoA)進入線粒體氧化供能。

綜上，缺氧可以刺激心肌自分泌MIF，MIF經跨膜信號轉導引起AMPK磷酸化，活化的AMPK促進脂肪酸代謝，加強氧化供能，為缺氧提供代償性保護。我們的研究只靜態地觀測了一個時間點，對心肌缺氧后能量代謝進行了初步框架性研究，其動態過程還有待今后深入探究。

4 結 論

采用體外心肌細胞缺氧模型及MIF阻斷法證明，缺氧可以刺激心肌自分泌MIF，MIF經跨膜信號轉導引起AMPK磷酸化，活化的AMPK促進脂肪酸代謝，為缺氧心肌提供代償性能量供應。

[1] SHEN Y R, SHI S R, TONG H B, et al. Metabolomics analysis reveals that bile acids and phospholipids contribute to variable responses to low-temperature-induced ascites syndrome[J].MolBiosyst, 2014, 10(6): 1557-1567.

[2] ZHANG J J, FENG X J, ZHAO L H, et al. Expression of hypoxia-inducible factor 1α mRNA in hearts and lungs of broiler chickens with ascites syndrome induced by excess salt in drinking water[J].PoultSci, 2013, 92(8): 2044-2052.

[3] YANG F, CAO H B, XIAO Q Y, et al. Transcriptome analysis and gene identification in the pulmonary artery of broilers with ascites syndrome[J].PLoSOne, 2016, 11(6): e0156045.

[4] LI H Y, WANG Y M, CHEN L L, et al. The role of MIF, cyclinD1 and ERK in the development of pulmonary hypertension in broilers[J].AvianPathol, 2017, 46(2): 202-208.

[5] TAN X, HU S H, WANG X L. Possible role of nitric oxide in the pathogenesis of pulmonary hypertension in broilers: a synopsis[J].AvianPathol, 2007, 36(4): 261-267.

[6] LI K, ZHAO L H, GENG G R, et al. Increased calcium deposits and decreased Ca2+-ATPase in erythrocytes of ascitic broiler chickens[J].ResVetSci, 2011, 90(3): 468-473.

[7] WALLHAUS T R, TAYLOR M, DEGRADO T R, et al. Myocardial free fatty acid and glucose use after carvedilol treatment in patients with congestive heart failure[J].Circulation, 2001, 103(20): 2441-2446.

[8] RAMANNA H, ELVAN A, WITTKAMPF F H, et al. Increased dispersion and shortened refractoriness caused by verapamil in chronic atrial fibrillation[J].JAmCollCardiol, 2001, 37(5): 1403-1407.

[9] NEUBAUER S. The failing heart—an engine out of fuel[J].NEnglJMed, 2007, 356(11): 1140-1151.

[10] STANLEY W C, RECCHIA F A, LOPASCHUK G D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart[J].PhysiolRev, 2005, 85(3): 1093-1129.

[11] MA H, WANG J J, THOMAS D P, et al. Impaired macrophage migration inhibitory factor (MIF)-AMPK activation and ischemic recovery in the senescent heart[J].Circulation, 2010, 122(3): 282-292.

[12] MILLER E J, LI J, LENG L, et al. Macrophage migration inhibitory factor stimulates AMP-activated protein kinase in the ischaemic heart[J].Nature, 2008, 451(7178): 578-582.

[13] SIMPSON P, SAVION S. Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol[J].CircRes, 1982, 50(1): 101-116.

[14] WIDEMAN R F, RHOADS D D, ERF G F, et al. Pulmonary arterial hypertension (ascites syndrome) in broilers: a review[J].PoultSci, 2013, 92(1): 64-83.

[15] OLKOWSKI A A. Pathophysiology of heart failure in broiler chickens: structural, biochemical, and molecular characteristics[J].PoultSci, 2007, 86(5): 999-1005.

[16] HASSANZADEH M, BUYSE J, TOLOEI T, et al. Ascites syndrome in broiler chickens: a review on the aspect of endogenous and exogenous factors interactions[J].JPoultSci, 2014, 51(3): 229-241.

[17] BAGHBANZADEH A, DECUYPERE E. Ascites syndrome in broilers: physiological and nutritional perspectives[J].AvianPathol, 2008, 37(2): 117-126.

[18] MAXWELL P H, WIESENER M S, CHANG G W, et al. The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis[J].Nature, 1999, 399(6733): 271-275.

[19] JAAKKOLA P, MOLE D R, TIAN Y M, et al. Targeting of HIF-α to the von hippel-lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation[J].Science, 2001, 292(5516): 468-472.

[20] KALLIO P J, WILSON W J, O′BRIEN S, et al. Regulation of the hypoxia-inducible transcription factor 1α by the ubiquitin-proteasome pathway[J].JBiolChem, 1999, 274(10): 6519-6525.

[21] WELFORD S M, BEDOGNI B, GRADIN K, et al. HIF1α delays premature senescence through the activation of MIF[J].GenesDev, 2006, 20(24): 3366-3371.

[22] RUSSELL III R R, LI J, COVEN D L, et al. AMP-activated protein kinase mediates ischemic glucose uptake and prevents postischemic cardiac dysfunction, apoptosis, and injury[J].JClinInvest, 2004, 114(4): 495-503.

[23] OAKHILL J S, STEEL R, CHEN Z P, et al. AMPK is a direct adenylate charge-regulated protein kinase[J].Science, 2011, 332(6036): 1433-1435.

[24] ADACHI Y, KANBAYASHI Y, HARATA I, et al. Petasin activates AMP-activated protein kinase and modulates glucose metabolism[J].JNatProd, 2014, 77(6): 1262-1269.

[25] WANG J Y, TONG C, YAN X Y, et al. Limiting cardiac ischemic injury by pharmacological augmentation of macrophage migration inhibitory factor-AMP-activated protein kinase signal transduction[J].Circulation, 2013, 128(3): 225-236.

[26] MU J, BROZINICK J T Jr, VALLADARES O, et al. A role for AMP-activated protein kinase in contraction-and hypoxia-regulated glucose transport in skeletal muscle[J].MolCell, 2001, 7(5): 1085-1094.

[27] 韓麗娟. 肉雞腹水綜合征(AS)中MIF與AMPK表達關系的研究[D]. 太谷: 山西農業大學, 2015.

HAN L J. The relationship between MIF and AMPK expression in ascites syndrome (AS)[D]. Taigu: Shanxi Agricultural University, 2015. (in Chinese)

[28] PIRRO M, MAURIGE P, TCHERNOF A, et al. Plasma free fatty acid levels and the risk of ischemic heart disease in men: prospective results from the Québec cardiovascular study[J].Atherosclerosis, 2002, 160(2): 377-384.