熒光免疫層析芯片檢測系統信號提取方法研究*

侯亞飛, 王 侃,2, 秦偉健, 肖 琨，顏文強，崔大祥,2

(1.上海交通大學 電子信息與電氣工程學院 儀器科學與工程系,上海 200240；2.上海智能診療儀器工程技術研究中心，上海 200240)

0 引 言

被廣泛應用于即時檢測(point-of-care test，POCT)[1～3]行業的熒光免疫層析芯片具有靈敏度高、特異性強、生物相容性好、速度快等優點[3]，并且結合傳感器技術和便攜式檢測系統可以實現標記物的定量檢測。生物相關的傳感器和檢測系統也逐漸成為研究熱點[4～6]。目前，熒光免疫層析芯片的檢測系統主要基于臺式計算機處理或者嵌入式技術開發，體積大，便攜性差，檢測速度有待提高。前期研究中，基于嵌入式技術實現的血液中C反應蛋白檢測系統，整體變異系數高、穩定性差[7]。該技術實現的掃描式熒光檢測系統存在檢測速度慢的不足[8]。隨著智能手機的普及，開發基于智能手機的快速定量芯片檢測系統具有極大的應用前景[9,10]。

本文針對熒光免疫層析芯片檢測系統，開發了一種應用于智能手機的熒光芯片圖像特征提取和識別的方法，識別熒光芯片的信號區域并提取信號強度。實驗表明:能夠準確識別熒光芯片的信號區域，并準確提取信號強度。在熒光免疫層析芯片檢測系統中，熒光信號強度和分析物濃度呈正相關。表明該熒光信號提取方法準確，適用于基于智能手機的熒光芯片檢測系統。

1 方 法

1.1 免疫層析芯片結構

免疫層析芯片主要包括5個部分：樣品墊、結合墊、硝酸纖維素((nitro-cellulose filter,NC)薄膜、吸收墊和聚氯乙烯 (polyvinyl chloride,PVC)背板。結構如圖1所示。PVC背板用于提供結構支持；樣品墊用于滴加待測樣品；結合墊用于固定熒光免疫探針，結合墊的一部分延伸到樣品墊下方，使得待測樣品和結合墊上抗體充分反應；硝酸纖維素薄膜用于固定抗體和二抗，分別作為檢測線(test line ,T線)和控制線(control line,C線)；吸收墊用于提供層析的動力，同時將多余的液體樣品吸收，以降低對信號判讀和檢測的影響。

圖1 熒光免疫層析芯片結構

1.2 免疫層析芯片層析原理

熒光免疫層析技術是將免疫標記技術與層析技術結合的一種新型檢測技術，利用熒光標記物被激發后的熒光顯色特性，實現對待測物的定性及定量分析。由于硝酸纖維素膜是微孔結構，以其為固相載體，待測液為流動相，利用微孔濾膜的毛細及虹吸作用引導待測液體向前流動，同時待測液中的相關成分和固定在NC膜上的抗原或抗體發生反應，形成免疫復合物后，滯留在檢測區域，形成T線和C線。通過對標記物熒光強度進行分析，得到定量的檢測結果。整個層析過程用時約2～4 min。

1.3 免疫層析芯片信號區域識別與信號強度提取

如圖1所示，有效的信號區域為矩形結構，首先要確定矩形區域的坐標位置，然后再提取信號區域的熒光信號強度。通過對比多種圖像處理方法，最終采取的處理步驟包括：灰度化處理，改進的Sobel算子進行卷積運算，閾值分析，二值化，投影法獲取檢測區域邊界坐標，對信號區域的色彩值提取。算法流程如圖2。

圖2 圖像處理算法流程

1)將色彩的紅綠藍 (red，green，blue，RGB)三通道的圖像轉化為單通道的灰度圖像，得到灰度圖像后，使用改進的Sobel算子進行卷積運算提取圖像邊界。對比相關邊緣檢測算子，對于圖像邊界處理改進的Sobel算子更能突顯邊界去除背景干擾。另外，對比了霍夫直線檢測算法，雖然該算法對于檢測直線有一定的優越性，而且芯片圖像上以直線為主，但是該算法實際應用比較耗時。因此，最終使用改進的Sobel算子進行邊界提取

(1)

2)將經過卷積運算之后的圖像進行閾值分割，進行二值化處理。分別使用最佳閾值分割法、直方閾值選擇法和多次實驗法進行閾值計算。最佳閾值分割法單獨使用效果雖好，但是比較耗時。在檢測環境不變的情況下，每次處理的芯片圖像結構相似，所以,將最佳閾值分割法求得的閾值作為參考值固定在程序中。然后將高于閾值的像素值置為0(黑色)，低于閾值的像素值置為1(白色)，從而實現邊界區域與背景區域的分離，如圖3所示。

圖3 芯片坐標標識

3)進行圖像中邊界位置的確定(如圖3標示的坐標點)。首先檢測左右邊界的坐標值(Left_x和Right_x，如圖3所標識)。研究分別對比了2種算法：二分求極值和中心擴展法。二分求極值法，先將二值化圖像矩陣中每一列像素值求和，得到一個一維數組，數組從中間分開，分別對前半部分求最大值及其對應的坐標值，得到了左右邊界的坐標位置。中心擴展方法，同樣將二值化圖像矩陣中每一列像素值求和，得到的一維數組，從中間向兩邊擴展的過程中，設定一個閾值如式(2)～式(5)，一旦超過閾值T便認為找到了邊界。由于邊界線具有一定的寬度，二分求極值法的獲取的是邊界線在其寬度范圍內的中心位置；中心擴展方法則計算得到的是左右邊界線寬度范圍內的內邊距的位置。實驗目的是獲取信號區域，因此,界定的其邊界范圍要適當排除邊界線的干擾，因此,第二種方法更準確一些。通過偽代碼程序(1～16行)分別計算出芯片的左右邊界值

(2)

(3)

(4)

(5)

式中S(xi,yj)為M×N的圖像中像素值；X(i)為M×N的矩陣中第i列元素的和；Xextr1和Xextr2分別為兩個極大值。

1.Int get_left_x(){

2.fromk=N/2 to 0

3.ifX(k)>T

4.left_x=k;

5.return left_x;

6.end;

7.end;

8.}

9.Int get_right_x(){

10.fromk=N/2 toN

11.ifX(k)>T

12.right_x=k;

13.return right_x;

14.end;

15.end;

16.}

4)獲得T線和C線上下四條邊的縱坐標(T_line_y1,T_line_y2,C_line_y1和C_line_y2，如圖3所示)。采用了兩步法：1)將二值化圖像矩陣中每一行的像素值相加，得到一個一維數組，并用輾轉求極值的方式，如式(6)～式(8)，求出的極值中找出4個最大值;2)將該坐標值從小到大排列如式(9)，其中，n1為k1～k4中最小的一個，n2為k1～k4中次小值，其他以此類推。Y(j)為M×N的矩陣中第j行元素的和；Yextr(k)為Y(j)中的極大值，則T線和C線的邊界坐標對應式(10)～式(13)。

經過上述理論分析從而實現芯片有效檢測區域的自動準確識別，相比于其他檢測設備具有很大的進步，同時也增強了用戶體驗

(6)

20≤k≤N-20

(7)

Yextr(k1)>Yextr(k2)>Yextr(k3)>Yextr(k4)

(8)

Sort(k1,k2,k3,k4)=[n1,n2,n3,n4|n1

(9)

C_line_y1=n3

(10)

C_line_y2=n4

(11)

T_line_y1=n1

(12)

T_line_y2=n2

(13)

2 MATLAB模擬仿真與智能平臺的仿真應用

2.1 MATLAB模擬仿真

基于上述算法理論，首先,在MATLAB上實現了模擬計算用于可行性分析，對于信號區域邊界的提取方式符合預期結果。免疫層析芯片圖片實際的位置坐標為left_x=170，right_x=331，T_line_y1=293，T_line_y2=350，C_line_y1=506，C_line_y2=565。圖4(a)和圖4(b)，將二值化圖像(圖3)按照每列求和和每行求和，分別得到兩個曲線，其中標示出了峰值坐標，與在芯片圖片的實際坐標位置一致。

圖4 MATLAB芯片信號區域坐標識別

對其區域信號進行提取。對于圖像的信號處理，采用RGB色彩模式，分析每一個通道數據，針對于熒光芯片，根據圖5中3個通道信號強度對比，只有R通道信號最明顯，G和B通道基本無熒光信號強度的體現，因此，本文只需提取相應的R通道數據進行熒光信號。

圖5 熒光芯片RGB通道像素值

2.2 智能手機應用

選擇基于Android系統的智能手機，采用Java編程語言，開發手機端的應用程序。最終，實際使用效果與MATLAB對比結果一致，詳見表1，驗證了該算法的合理、可行性。如表1所示，原圖中對應的坐標位置和MATLAB計算的結果以及智能手機算法實現的結果基本一致。說明了該方法對于區域圖像坐標的識別具有良好的特性。圖6中，智能手機自動使用線條標示出了信號區域，完全符合預期。

表1 芯片信號區域位置坐標

圖6 Android應用軟件算法實現

3 實驗驗證

將該方法應用于基于智能手機的熒光芯片檢測系統中進行實驗。研究以癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)為熒光免疫層析芯片分析物，分別檢測不同濃度條件下系統的熒光信號強度與濃度的相關性。樣品選用濃度依次為：1，2.5，5，10，20，30，40，50 ng/mL。檢測過程中，所有的信號區域均準確地標定出來。提取被標定的區域熒光信號，計算T線和C線的熒光強度之比。比值與樣品濃度呈現正相關，如圖7(a)所示。根據多次重復檢測，計算樣品濃度和T線與C線的比值的標準曲線y=0.093 8lnx+0.321 3，如圖7(b)所示，二者相關系數R2=0.948。根據該標準曲線，可以實現快速、便捷的定量檢測樣品濃度。CEA的理論檢測下限達到0.03 ng/mL，相對于其他的檢測方法[11,12]，更加準確，也更好地滿足臨床需求。進一步驗證了該算法不僅可以準確識別芯片信號區域、提取熒光信號，而且適用于芯片監測系統中。

圖7 檢測儀器系統定量檢測結果

4 結 論

經過一系列的MATLAB仿真分析和驗證，提出的熒光芯片信號區域提取方法不僅可以準確地識別熒光芯片的信號定位，而且合理地提取了熒光信號，進行處理分析，得到滿意的定量檢測結果。將方法應用到基于智能手機的檢測程序中，可以實現快速、高效、便捷的熒光層析芯片定量檢測。通過臨床應用進一步驗證了算法的合理性和準確性。檢測方法具有很高的實用性和可移植性，可應用于不同的移動客戶端芯片檢測系統中，并且可方便地拓展到多指標的芯片檢測系統中。

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崔大祥(1967-)，男，通訊作者，教授，長江特聘教授，博士生導師，國家杰出青年基金獲得者，納米重大科學研究計劃項目首席科學家,主要研究領域為納米材料的制備、生物學效應與安全性評價，基于納米粒子標記與納米效應的腫瘤早期診斷系統與傳感器的研制，多功能納米探針與腫瘤的分子影像，胃癌相關的基因與蛋白質的結構與功能研究，基于納米技術的CIK與干細胞治療，高效基因或藥物遞送系統，E—mail：wk_xa@163.com。