無創性結直腸癌生物標志物概要

梁媛紫 徐軍發★ 黃華藝

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球3大常見的惡性腫瘤之一［1?2］。絕大部分CRC的發生、發展是一個多步驟、多階段、多基因參與的過程，是外在環境因素和機體內在遺傳因素相互作用的結果。CRC早期癥狀不明顯，通常出現臨床癥狀時已發展為難治愈的階段，因此被稱為“沉默”的疾病［3］。CRC篩查5年存活率約為90%［4］。大多數結直腸癌是由息肉發展而來，即結直腸息肉為癌前病變疾病，如果息肉能在早期被發現并去除，就能預防結直腸癌的發生。因此，結直腸癌的早期診斷尤顯重要。

分子標志物的檢測是臨床CRC篩查的一個很有前景的方法。然而，目前可用于檢測早期CRC疾病進展的有效分子標志物不多，檢測的靈敏度和特異性不理想仍然是亟待解決的問題。從技術上來說，檢測CRC的手段可分為有創性和無創性檢測2種技術，兩者各有優缺點。隨著研究的不斷深入，CRC分子標志物在CRC患者治療效果的監測、個性化治療方案的選擇和預后的評估中日益受到重視。為了合理使用現有的CRC標志物，本文根據文獻報道，對無創性CRC標志物的臨床應用價值、檢測的難易度和不足之處進行簡要概括。

1 糞便隱血試驗

愈創木脂法糞便隱血試驗（guaiac?based fecal occult blood test，gFOBT）是目前國內外最常用的結直腸癌篩查方法之一。對于檢測CRC，gFOBT靈敏度為65%，特異度為 77.87%［5］，具有簡便、快速、無創、檢測費用低等優點，也是唯一經前瞻性、隨機對照試驗證實有效的檢測方法，能使CRC的死亡率降低11%～33%［6］。雖然gFOBT的靈敏度和特異度都不高，且易受食物和藥物影響出現假陽性，但由于檢測的方便性和實用性，仍然受到臨床的青睞。

2 糞便血紅蛋白檢測

糞便免疫化學檢測（fecal immunochemical test，FIT），其原理是建立在針對人血紅蛋白抗原的基礎上的特異性抗原?抗體反應。在無癥狀的CRC高危人群中靈敏度為80%，特異度為90.12%［5］。FIT避免了gFOBT易受藥物和食物影響的特點，具有更高的靈敏度，小量糞便樣本即可檢測。研究發現，FIT對大腸癌及腺瘤性息肉的檢出率更高，且由于其對患者無飲食和藥物的限制，患者更傾向于 FIT［7?8］。為預防CRC的發生，美國預防服務工作組（U.S.Preventive Services Task Force，USPSTF）推薦每年應進行一次FIT檢測。綜合方法學性能和實用性等方面的比較，FIT的優勢比gFOBT大。

3 基于糞便CRC相關檢測

3.1 基于基因突變的DNA檢測

糞便DNA檢測是針對人血紅蛋白和特異性基因改變的非侵入性篩查檢測，多年來CRC常見的基因突變頻率一直是人們關注的焦點。基因APC和P53突變可作為 CRC 預后不良的標志物［9?10］；基因KRAS、BRAF和PIK3CA突變檢測是抗表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）治療的依據，根據檢測結果評估CRC患者是否適合使用相應的靶向治療藥物［11］。其他常見的突變基因有ARID1A、SMAD4、CTNNB1、TGFBR2、SOX9、FAM123B和ERBB2，這些突變基因通過干擾關鍵信號通路（包括Wnt?β?連環蛋白通路、EGF?MAPK通路、PI3K和TGF?β通路等）的功能或阻礙DNA復制、修復等功能，促進CRC的發生發展［12］。在糞便異常脫落細胞中小碎片癌組織即可發現DNA點突變，通過相關DNA檢測便可對CRC進行篩查，故糞便DNA檢測比血液DNA檢測簡單。

近年來關于CRC篩查試劑盒的研發越來越多，其中Cologuard是美國食品藥物管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準的首個非侵入性CRC篩查試劑盒，通過分析糞便異常DNA和血紅蛋白對CRC進行篩查，總靈敏度為92.3%，特異度為87%，其靈敏度比FIT高［13］。此外，由中山大學附屬第六醫院研發的大腸癌糞便無創篩查試劑盒“長安心”，對糞便中CRC和癌前腺瘤的異常基因標志物的檢出率分別超過90%和60%［14］，這在CRC的篩查、診斷、治療和預后評估等領域取得一定的突破和發展。

3.2 基于表觀遺傳學的DNA檢測

由于遺傳和表觀遺傳變異共同影響CRC的發展，DNA甲基化生物標志物的使用對提高目前CRC的篩查、診斷、治療和預后評估具有很大的潛在價值。經獨立驗證且深入研究的CRC診斷 基因有VIM、SEPT9、ITGA4、OSM4、GATA4和NDRG4［15］，理論上這些甲基化標志物與長分散元件1（long interspersed element 1，LINE1）甲基化聯合檢測的靈敏度比FIT的靈敏度高；而經獨立驗證的預 后 基 因 有myopodin、KISS1、TMEFF2、HLTF、hMLH1、APAF1、BCL2和p53［15］。甲基孕激素受體（methylated progesterone receptor，mPGR）和 O6?甲基鳥嘌呤?DNA 甲基轉移酶（O6?methylguanine?DNA methyltransferase，mMGMT）是糞便獨有的生物標志物［16］。與血液標本相比，糞便中大量超甲基化基因的檢出率高。因此，糞便DNA甲基化標志物可能比血液中的生物標志物更有篩查價值。

3.3 基于遺傳特征的CRC檢測

已知，5%～10%CRC由無蒂鋸齒狀腺瘤（sessile serrated adenoma，SSA）和鋸齒狀腺瘤演變而來。這2種腺瘤經過一系列組織學和分子學的改變，逐漸由腺瘤發展為CRC［17］。基于基因和基因表型的變化，CRC的衍生途徑至少可分為3條：CpG島甲基化表型（CpG island methylator phenotype，CIMP）途徑（闡釋了一些以右半結腸息肉為主的息肉從SSA發展為CRC的過程）、微衛星不穩定性（microsatellite instability，MSI）途徑和染色體不穩定性（chromosomal instability，CIN）途徑，后2條途徑標志著腺瘤轉化為CRC。

CRC主要由染色體不穩定性途徑引起，CIN導致染色體拷貝數改變是CRC的一個標志。染色體隔離缺陷、端粒酶功能缺失、DNA損傷等功能障礙都會導致染色體不穩定和雜合性丟失。研究發現，染色體 1p36、1p12、1q21、9p13、14q11、16p13 和16p12缺失在年輕CRC患者中更易見，而染色體7q11和7q22增多在老年患者中更易見［18］。另外，基因p53和BUBR1表達異常與CIN的發生有關［19］。然而，機體內導致CIN基因突變的類型和模式更為復雜，有待進一步研究。

錯配修復系統（mismatch repair，MMR）對DNA復制校正意義重大，主要由MLH1，MSH2，MSH6和PMS2這4個錯配修復基因構成。MMR任何一個蛋白功能喪失都會導致微衛星不穩定性，從而有可能導致癌癥發生。MSI反映了DNA錯配的修復能力，因此MSI是引發CRC的一個途徑［20］。Lynch綜合征（又稱遺傳性非息肉性結直腸癌）通常表現為基因MLH或MSH2的突變，而散發性CRC與基因hMLH1甲基化有關。新提出的MSI標志物基因組由BAT?25、BAT?26、NR21、NR24和NR27組成，其中微衛星高度不穩定表型（microsatellite instability?high，MSI?H）CRC定義為5個標志物中至少有2個顯示不穩定，而大部分散發性CRC缺乏MSI特征，定義為微衛星穩態［20］。

SSA是鋸齒狀腫瘤形成途徑的癌前病變。基因的異常插入或缺失等會引起基因組不穩定，大多情況下會導致高頻微衛星不穩定性（MSI?H）腺癌的發生，其中基因BRAF的突變和SLC5A8的高甲基化就是引起MSI?H腺癌的重要影響因素［21］。

CRC的各種遺傳途徑共同作用并單獨存在，同一個腫瘤通常由多重途徑同時作用［22］。因此，CRC的遺傳學改變因素復雜，相應的生物標志物也復雜多樣，這給CRC的檢測帶來一定的挑戰性。

3.4 基于多種標志物組套檢測

多靶位糞便 DNA（multitarget stool DNA，MT?sDNA）測試于2014年被批準作為CRC平均風險的篩查項目，隨后被FDA納入醫療報銷項目［23］。盡管MT?sDNA檢測對CRC早期篩查具有高度靈敏度，美國預防服務工作小組（USPSTF）在2015年10月草案建議將該檢測僅視為“可替代”或“可能有用的臨床篩選”試驗［24］。第一代MT?sDNA原型測試（包括KRAS基因突變，VIM、NDRG4、BMP3及TFPI2甲基化，β?肌動蛋白和血紅蛋白）檢測CRC的靈敏度為87%，進展性腺瘤（advanced adenoma，AA）54%～92%（具體取決于息肉的大小）［25］。更為精準的第二代MT?sDNA自動化測試（包括KRAS基因突變，NDRG4及BMP3甲基化，β?肌動蛋白和血紅蛋白）檢測CRC的靈敏度為95%～97%，AA為57%～83%，AA的靈敏度取決于腺瘤的大小［25］。整體上，MT?sDNA檢測CRC的靈敏度為93%，AA和無蒂鋸齒狀腺瘤為42%～66%（具體取決于息肉的大小），總體特異度為87%～90%。與gFOBT及FIT相比，MT?sDNA試驗的檢出率更高，但是檢測成本昂貴。許多數據表明，每3年進行一次MT?sDNA檢測其性能和成本達到最優化［26］。

3.5 基于蛋白質和RNA的檢測

糞便中蛋白質和RNA作為早期篩查和診斷CRC的生物標志物越來越受關注。其中腫瘤M2型丙酮酸激酶（tumor M2 pyruvate kinase，M2?PK）來源于大腸腫瘤細胞，而免疫層析M2型丙酮酸激酶（immunochromatographic fecal tumor M2 pyruvate kinase，iM2?PK）是潛在的篩查 CRC 的生物標志物。Kim等［27］檢測CRC患者的iM2?PK值，所得的CRC靈敏度為92.8%，腺瘤靈敏度為69.4%。通過與免疫層析糞便隱血試驗（immunological fecal oc?cult blood test，iFOBT）及糞便M2?PK酶聯免疫吸附試驗比較，三者中iM2?PK值的靈敏度最高，且由于其檢測快速方便，是很有前景的CRC篩查標志物。鈣衛蛋白（calprotectin）是中性粒細胞和巨噬細胞胞漿來源的含鈣蛋白，是一種糞便中穩定的炎性標志物。對于可疑的CRC患者具有較高的陰性預測值［28］，鈣衛蛋白的檢測有望提高CRC的檢出率。

此外，糞便微小RNA（miRNA）也可用于CRC的早期診斷，如 miR?29a、miR?223 和 miR?224［29］。糞便蛋白質和RNA的檢測在一定程度上提高了CRC的檢出率，但目前這些發現仍在研究階段，還未在臨床上實踐應用。

3.6 基于微生物組的檢測

腸道菌群失調與腸道腫瘤的發生和發展有關。CRC患者腸道菌群組成與健康人群腸道菌群組成不一樣，與不同黏膜的基因表達譜相關［30］。CRC患者腸道菌群主要包括梭桿菌、脆弱類桿菌和致病性大腸桿菌等［31］。這些病原微生物在腸道局部黏膜定植啟動CRC，微生物在黏膜周圍不斷定植引起后續變化，從而促進疾病的進展。因此，篩查這些病原微生物有望能對CRC進行早期診斷或預防性干預［32］。然而，宿主與病原菌之間相互作用的機制仍不太清楚，由于黏膜相關微生物與糞便微生物不同，目前對于選定哪種樣本的微生物篩查CRC還未達成共識。以上闡述歸納于表1。

4 血液相關CRC標志物

4.1 異常DNA甲基化標志物

近年來，血漿中CRC相關的異常DNA甲基化標志物已投入大量研究，其中血漿SEPT9甲基化（mSEPT9）是研究熱點。SEPT9是隔膜蛋白家族中的一員，與胞質分裂及細胞周期調控有關。mSEPT9試驗多應用于CRC的早期診斷，靈敏度為76.6%，特異度為95.9%，聯合血漿癌胚抗原檢測敏感度為86.4%，聯合FIT靈敏度達94.4%［33］，mSEPT9還可能是CRC治療檢測和預后判斷的標志物［34］。此外，基因BCAT1和IKZF1甲基化的聯合檢測CRC的靈敏度為77%，特異度為92.4%。由于2個基因都與腫瘤的生長及侵襲性相關，聯合的甲基化程度與腫瘤進展的程度相關，可用于CRC的分期評估［35］。血漿異常DNA甲基化標志物的聯合檢測可提高CRC的檢測率。

表1 糞便中CRC相關生物標志物Table 1 Stool CRC biomarkers

4.2 RNA標志物

RNA的種類較多，如信使RNA（mRNA）、微RNA（miRNA）和長鏈非編碼RNA（LncRNA）等，具有胞外性能穩定，且易于提取和保存等優點，在不同體液中均可研究。在腫瘤組織中，RNA表達高度異常，因此RNA更適合應用于腫瘤性能分析的研究。實時定量PCR（real time quantitative PCR，qPCR）是最先用于測定mRNA表達微陣列譜的方法，后來逐漸被下一代基因測序（next generation sequencing，NGS）技術取代。NGS技術具有簡單、成本低和快速等優點，且能精準地測出整個轉錄組的序列［36］。

4.3 miRNA標志物

miRNA是一類內生的、長度約為20～24個核苷酸的小RNA，在細胞內具有多種重要的調節功能，與癌癥的發展及轉移有關，血清miRNA是潛在的CRC預后生物標志物［37］。miRNA對腫瘤細胞具有正調節和負調節作用，可表現為原癌基因、抑癌基因或者兩者兼為。miR?17?3p、miR?92、miR?29a、miR?141、miR?21、miR?152、miR?7和 miR?92a等與晚期CRC有關［38?41］，提示預后差；miR?143、miR?195、miR?146a?5p、miR?140、miR?375和miR?577可抑制CRC的發展和轉移［42?47］，有望成為CRC的替代治療藥物。然而，對于標本的采集、miRNA的提純和分析的方法還未標準化，限制了miRNA的有效測試。

4.4 lncRNA標志物

lncRNA的長度大于200 nt，具有mRNA樣結構。lncRNA通過干預mRNA的活性參與CRC的發展、侵襲和轉移過程，對CRC早期診斷、預后、耐藥和抗輻射等發揮重要作用。lncRNA直接與蛋白質結合以調節其活性或改變其定位，與內源RNA競爭通過抑制RNA聚合酶和調節基因表達來影響下游基因的表達，具有激活或抑制癌細胞的雙重作用［48］。Li等［49］發現共有 21 個相關 lncRNA在結直腸癌組織和癌旁組織中的表達異常，其中7 個變化明顯：AFAP1?AS1、BCAR4、H19、HOXA?AS2、MALAT1和 PVT1在 CRC組織中上調，ADAMTS9?AS2下調，提示CRC患者預后不良。lncRNA有望成為CRC的診斷和治療靶點。

4.5 循環腫瘤DNA標志物

循環腫瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是新興的無創多功能的體液活檢生物標志物，與CRC的早期診斷、治療靶點的選擇、癌細胞轉移的檢測以及抗治療等相關［50］。CRC患者血液中出現ctDNA是其復發和總生存期評估的一個指標［51］。ctDNA檢測未來在臨床到底能否應用，還有待更深入的研究。

表2 血液中CRC相關生物標志物Table 2 Blood?based CRC biomarkers

4.6 干細胞CRC標志物

腫瘤干細胞可分化成更成熟的腫瘤細胞，具有自我更新的能力，與腫瘤的發生、發展、轉移和復發相關，是腫瘤產生耐藥性的主要原因［52］。干細胞作為 CRC 標志物有 Nanog、Oct?4、Sox?2、lgr?5、CD133、CD24、CD29、ALDH1、EpCAM、CD44、CD166和CD26，通常用于干細胞的分離鑒定。此外 ，ALDH1、CD24、CD44、CD133、CD166、Ep?CAM、lgr?5、Nanog和Sox?2可對CRC的病理分期、治療、癌癥復發和患者的生存率等進行評估［53］。腫瘤干細胞是診斷和治療CRC新的研究方向。

4.7 血清（漿）可溶性蛋白CRC標志物

包括歐洲癌癥和營養前瞻性研究在內的多項前瞻性研究發現，血清或血漿中高濃度的C反應蛋白（c?reactive protein，CRP）與CRC風險升高有關，高水平CRP可能與CRC的發生有直接關系［54］。血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和CA19?9與CRC 的嚴重程度及轉移有關［55］。另外，血管內皮細胞生長因子C（vascular endothelial growth factor，VEGF?C）的過度表達與CRC患者的總生存期相關［56］；細胞角化因子20（cytokeratin 20，CK20）與CRC的治療有關［57］。單個可溶性蛋白標志物用于診斷CRC時，往往缺乏敏感性，而多個標志物聯合檢測可提高敏感性。如胰島素樣生長因子結合蛋白2（insulin like growth factor binding protein?2，IGFBP2）、Dickkopf?3（DKK3）和丙酮酸激酶 M2（pyruvate kinase M2，PKM2）可用于診斷CRC［58］；甲基化FOXE1和SYNE1也是潛在的 CRC診斷標志物［59］。可溶性蛋白具有易于取材、檢測方便、易于自動化和重復性好的優點，易于推廣應用。以上闡述歸納于表2。

5 結語

一項理想的檢測應具有高度依從性、靈敏度和特異度、微創并保持一定的成本效益。CRC篩查仍存在許多局限性，例如來自組織（手術創傷性）和無創性（或微創性）的標本，其檢測結果之間的一致性問題，但隨著臨床研究的逐漸深入，在對CRC患者治療反應性的預測、個性化治療方案的選擇和預后的評估中，分子標志物也日益受到重視。本文所列舉的無創性CRC標志物中，糞便隱血試驗仍然是目前結直腸癌最主要的無創篩查方法，其他標志物雖然有很大潛在性，但真正應用于臨床檢測的不多。有些生物標志物靈敏度高，但特異度不高，或相反；有些則成本昂貴，且臨床意義不大，如一些基因檢測；標志物的聯合檢測雖然在一定程度上提高了CRC的檢出率，但關于項目的組合難以達成共識。因此無創性CRC標志物在臨床實踐方面仍存在許多需要解決的問題。總的來說，目前用于檢測CRC方法的靈敏度和特異性不夠理想，檢測操作繁瑣和成本高仍然是亟待解決的問題。

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