高通量測序技術在檢測循環腫瘤細胞中的應用

許芳 趙陽 武其文

腫瘤是威脅人類生命健康的一大重要因素，據統計全球1/8的死者死于癌癥，我國每一分鐘有6人確診為癌癥。由于傳統成像技術固有的局限性和缺乏特異性的腫瘤標志物導致多數惡性腫瘤預后不良和5年生存率較差。找到一種合理有效的方法對腫瘤患者進行早期診斷和治療具有重要意義，循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）作為新興的腫瘤標志物，可用于篩查、檢測、診斷、預后預測、分層、治療反應監測等。已證明在乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌等惡性腫瘤中，CTCs計數可作為獨立的預后判斷指標。但外周血中CTCs數量的稀有及其結構的異質性和聚集特性是影響其分離和分析的主要障礙［1］。幾種較常見的循環腫瘤細胞檢測實驗方法：免疫細胞化學法、逆轉錄聚合酶鏈反應、納米免疫磁珠富集檢測法等，由于自身各自的缺點在臨床應用中均受到不同程度的限制。目前，基因組學家強調對原發性腫瘤和部分轉移灶進行大規模測序以全面分析和理解癌癥基因組特征［2］。高通量測序從分子層面對CTCs進行基因序列分析以適應臨床需要。該技術采用大規模平行測序，能夠一次對數百萬至數十億個DNA片段進行序列測定，可完成在相對較低成本及不增加樣本量情況下，對上百個腫瘤相關基因、全外顯子以及全基因組進行檢測。高通量測序技術與CTCs的綜合運用在未來研究中展現出廣闊的前景，本文就二者的應用作一綜述。

1 循環腫瘤細胞

1.1 循環腫瘤細胞概述

CTCs常作為循環上皮細胞被檢測，在健康人群中非常罕見，但在各種實體瘤患者血液中可檢測到［3］，被稱為新興的腫瘤標志物，早在100多年前被提出，是原發性或轉移性腫瘤脫落進入到外周血液循環中的腫瘤細胞［4?5］。CTCs與原發腫瘤具有相似的遺傳特征，并可攜帶這些遺傳信息隨血液循環播散至全身各個器官［6］。原發腫瘤每天可釋放上萬個腫瘤細胞，但只有約0.01%CTCs可存活。有研究者采用白細胞分離法分別從7例直腸癌患者、5例乳腺癌患者以及3例胃癌患者外周血中獲得平均循環腫瘤細胞數各為 17.1（10?34）、10.0（2?27）、24.0（2?42），并對這些CTCs進行了成功培養［7］。隨著對CTCs的深入研究發現CTCs在血液運行過程中部分會發生上皮間質轉化（epithelial mesenchy?mal transition，EMT），這與干細胞表型有關，且EMT可幫助CTCs抵抗細胞凋亡信號，更好的存活和躲避治療藥物的攻擊，增強侵襲遷移能力［1］。CTCs表現出的這些生物學特點是我們甄選CTCs作為研究腫瘤的依據，是機遇也是挑戰，未來需要更深入的研究。

1.2 循環腫瘤細胞臨床價值

CTCs的臨床應用范圍從診斷、預后預測、合理治療方案選擇到臨床病理分期等。如根據早期腫瘤患者或術后近期內血液中有無CTCs再評估是否需要對那些具有高危轉移因素的患者進行放化療方面有重要指導作用［8］。CTCs可作為評估晚期癌癥患者治療是否有效的早期指標以及發現潛在靶向治療的新方法［9］。在結直腸癌中，KRAS基因的外顯子2突變是表皮生長因子受體抑制劑治療的不利標志［10］。CTCs還可能為原發性腫瘤和轉移腫瘤的分析提供遺傳信息。鑒于疾病發展過程中，惡性腫瘤可能會發生獲得性遺傳變異，CTCs作為一個實時的液體活檢可避免對轉移組織進行多次侵害性的病理活檢［11］。此外，CTCs計數還可作為監測化療療效的標志物，評估乳腺癌和前列腺癌患者對化療的反應［12?14］。根據 Scher和 Jia等［15］2 008 項研究數據分析發現，CTCs計數作為一個連續變量分析時，結合乳酸脫氫酶基點是一個重要的預后變量（一致性概率估計0.72至0.75）。在用醋酸阿比特龍治療前列腺癌的第二階段，有研究者根據治療后CTCs的變化評估47位難治性、去勢抵抗的前列腺癌患者對治療的反應，結果顯示治療后CTCs數量明顯減少，且ERG基因的重排和CTCs數量的減少之間具有明顯的相關性（r=0.762，P=0.001）［16］。對于膀胱癌切除術患者而言術前CTCs的存在是無癌生存期的獨立的不良預兆。最近一項研究表明CTCs依然是膀胱癌患者接受膀胱癌根除術但沒有輔以化療的癌癥特異性死亡率的獨立預兆［17］。

綜合上述觀點我們不難發現CTCs作為一種液體活檢標本，相比于影像學、病理組織學，血清標志物具有獨特的優勢，能夠提供更多的臨床信息。

2 循環腫瘤細胞檢測方法

2.1 免疫學技術

檢測CTCs最具有代表性的免疫學技術是基于免疫磁珠平臺的Cellsearch系統，該系統是目前唯一得到美國食品和藥物管理局批準的CTCs檢測系統［18］。該方法利用包被有上皮細胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗體的免疫磁珠，通過抗原抗體反應與外周血中所有表達EpCAM的細胞結合，從而分離捕獲CTCs，然后利用熒光標記的細胞角蛋白（cytokeratins，CK）抗體對CTCs進行識別鑒定。然而，關于是否所有的循環CK細胞都是腫瘤細胞仍然存在爭議。相反，對于重要的細胞亞群，如發生EMT的細胞存在漏檢，且因其無法檢測EpCAM陰性的細胞，使得檢測CTCs的敏感性和特異性降低。Li等［19］應用Cellsearch系統和依據細胞大小的膜濾法（isola?tion by size of epithelial tumor，ISET）對 61 例食管鱗狀細胞癌患者進行檢測，ISET方法檢測出CTCs有20例（32.8%），檢測出循環腫瘤微栓子3例（4.9%），而Cellsearch系統分別檢測出1例（1.6%）和0例。另外，該方法主要側重于循環腫瘤的計數，缺乏在基因層面的深入，在展現信息全面方面表現出一定的弊端，一項轉移性乳腺癌患者的研究報告顯示單純根據CTCs計數轉換治療并不能提高患者的總體生存率［20］。免疫學技術作為一種傳統檢測方法，應用廣泛，但隨著技術發展其弊端日益凸顯。

2.2 CTCs芯片技術

CTCs芯片技術使用抗EpCAM抗體包被的微流體裝置，基于EpCAM經常在肺癌、結直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、頭頸部腫瘤中過度表達，能夠從血液中特異性捕獲CTCs，細胞可快速分離并可視化，早期研究表明該技術在多種轉移癌中的檢出率達99%，且CTCs的數量多（平均50 CTCs/mL）［21?22］。然而，該技術主要用于 CTCs的捕獲和分離，因仍以抗體為基礎，同樣可因腫瘤細胞發生EMT，上皮抗原消失而敏感性降低。

2.3 逆轉錄 PCR（reverse transcription PCR，RT?PCR）技術

自20世紀90年代以來，RT?PCR開始用于檢測外周血中的腫瘤特異性核苷酸［10］。相比于依賴抗體結合的檢測方法其敏感性明顯提高，且可用于檢測血液中游離的RNA，應用范圍廣。但限于常見的靶RNA的非特異性表達、標本及PCR產物的污染、PCR擴增過程中條件控制不當、非特異性細胞低水平的非法轉錄等原因，使RT?PCR方法的檢測結果出現較高的假陽性率。此外，該技術無法用于觀察腫瘤細胞的形態學特征。

3 高通量測序在循環腫瘤細胞檢測中的應用

3.1 高通量測序技術

高通量測序又稱下一代測序（next generation se?quencing，NGS）或深度測序，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短著稱，引起業內廣泛關注。2015年初，國家衛生和計劃生育委員會首次批準了26家腫瘤診斷與治療采用高通量測序技術的應用試點單位，這預示著我國正逐步進入規范化的腫瘤高通量測序檢測行列。高通量測序檢測CTCs的實驗過程主要包括：抽取CTCs DNA?制備測序文庫?測序?生物信息分析，獲取高純度的CTCs DNA是檢測的前提，而先進的生物信息學分析技術是獲取檢測結果的保障。

3.2 高通量測序的應用

3.2.1 結直腸癌

高通量測序可揭示體細胞單核苷酸多態性和拷貝數變化，2013年 Heitzer等人［23］利用高通量測序技術對68個結直腸癌相關基因進行序列分析，比較原發腫瘤和轉移灶的突變譜及相應的CTCs，在相應的CTCs中檢測到已知的原發腫瘤和轉移灶的突變驅動基因［如結腸腺瘤樣息肉（APC），KRAS，PIK3CA］，并發現CTCs也存在基因突變。并且，利用深度測序分析這些突變的來源，發現原本在CTCs檢測出的大多數突變也存在于原發腫瘤和轉移灶。檢測腫瘤基因拷貝數往往受到正常細胞摻雜和非整倍數因素的影響，且正常細胞會干擾腫瘤細胞的基因信號，給全面分析腫瘤基因帶來挑戰，下一代測序技術提供了精確到堿基水平的基因信息，使檢測不同類型的基因變異以及確定基因片段大小、位置等信息成為可能。

3.2.2 胰腺癌

RNA測序可顯示腫瘤轉移的相關路徑，有研究人員采用微流控器對來自小鼠胰腺癌模型的內源性CTCs進行高效捕獲，并對CTCs進行單分子RNA測序，可篩選出Wnt2作為候選基因在CTCs中表達活躍［24］。在胰腺癌細胞中通過Wnt2的表達抑制失巢凋亡，增強非依賴貼壁球體的形成，增加體內轉移傾向。胰腺腫瘤細胞形成非粘附的腫瘤球體與多個Wnt基因表達上調有關，11例胰腺癌中有5例CTCs的Wnt信號表達豐富。由此對CTCs進行分子分析可確定治療靶點，預防腫瘤遠處擴散。

3.2.3 肺癌

有研究顯示通過對肺癌的CTCs外顯子組進行測序可發現其轉移和突變。Ni等人［25］對11例肺癌患者的CTCs進行外顯子基因組測序分析，發現特征性腫瘤相關的單核苷酸變異和CTCs外顯子的插入和缺失。這些突變可提供個體化治療所需的信息，如耐藥和表型轉變。此外，同一病人的每個CTCs，無論腫瘤亞型，具有的重復性拷貝數變異（copy number variation，CNV）模式與轉移瘤類似，同樣是肺腺瘤的不同患者，CTCs的CNV模式相似，而小細胞肺癌患者的CNV明顯不同于肺腺瘤患者。這表明特定基因位點的CNV可提示癌癥轉移，腫瘤特異性CNV的重復性提供了潛在的基于CTCs的臨床診斷價值。

3.2.4 膀胱移行細胞癌

2013年Guo等［26］利用全基因和全外顯子測序對99例膀胱移行細胞癌患者基因組進行分析，除了證實已被確定在移行細胞癌（transitional cell car?cinoma，TCC）中發生突變的基因外，還發現STAG2和ESPL1基因頻繁的突變以及FGFR3和TACC3重復性融合在姐妹染色單體的結合和分離（sister chromatid cohesion and segregation，SCCS）過程中發揮重要作用。研究表明基因突變對SCCS過程的影響可能參與了膀胱腫瘤的發生，為找到一種新的治療方法提供了思路。Sharron等［27］在2014年利用RNA測序對膀胱移行細胞癌進行分析，確定了一個在T1NPBCa（T1 nonprogressive bladder cancer）和 T1PBCa（T1 progres?sive bladder cancer）間表達差異顯著的基因標志?；谔卣鞯姆謱语@示基因識別標志與腫瘤由T1期發展到T2期的時間密切相關，表明分子標志可作為高評分T1膀胱癌發展的獨立預測因子。

3.2.5 頭頸癌

受各種因素的影響，近年來頭頸部腫瘤的發病率和致死率持續上升，其中以青年患者尤為突出，美國在2014年有73 240例患者確診為頭頸癌，27 450例患者死于頭頸癌［28］。早在2011年發表在Science雜志上的2篇文章同時報道了利用高通量測序技術對頭頸部鱗癌進行分析，發現在頭頸部腫瘤患者中存在大量的堿基突變，其中以TP53、CDKN2A、PIK3CA、NOTCH1基因的突變最為普遍，在HPV陰性的腫瘤患者中，這種突變更為常見［29?30］。2014 年有學者對TP53、NOTCH1基因在頭頸腫瘤中的變化進行了更為詳細深入的研究和報道［31?32］。Farah等［33］分別從轉化性研究、個性化醫學、驗證目標基因、癌癥藥物基因組、藥物靶點、未來可能采取的治療方法等方面詳細描述了NGS在頭頸癌中的應用。

3.2.6 乳腺癌

對乳腺腫瘤進行分子層面分析可促進耐藥機制的研究，如雌激素受體靶向治療乳腺癌出現耐藥是由于ESR1基因發生了突變［34］。由于血液CTCs非常少，高純度的DNA量獲取困難，一般難以達到高通量測序平臺檢測的下限，這也是高通量測序技術的一大重要挑戰。最近的一項研究很好的解決了這一問題，該研究綜合運用全基因組擴增（whole genome amplification，WGA）和NGS對比分析了乳腺癌細胞株和經乳腺癌細胞株轉染而成的癌細胞，提出在WGA過程中使用DNA無創管可解決WGA試驗與細胞固定劑不相容問題［35］。

通過上述實例，我們不難看出高通量測序技術在檢測循環腫瘤細胞，從分子層面研究腫瘤疾病等方面具有重大的應用價值。相信隨著技術的不斷發展和完善，高通量測序技術可以揭示更多的腫瘤基因信息，為腫瘤的預防、診斷、治療奠定夯實的理論基礎，為腫瘤病人帶去真正的福利。

4 展望

目前，人們越來越重視從基因層面分析腫瘤疾病，CTCs很早就開始進入人們視野，但限于在外周血中的量稀少以及受技術的限制，無法廣泛應用。近年來，隨著各種CTCs富集和檢測技術的發展，尤其是在高通量測序技術的推動下，CTCs又重新受到人們的關注。對CTCs的研究有利于更好的理解為什么同一種癌癥中的細胞具有不同的侵襲和轉移能力、對同一種藥物產生不同的治療效果，更好的為癌癥患者提供個體化的治療方案。2015年國家衛生計生委婦幼司發布了第一批高通量測序技術臨床應用試點單位，這是對高通量測序的高度認可。高通量測序技術應用的范圍非常廣泛：人類千人基因組計劃、動植物全基因組研究、表觀遺傳研究和甲基化分析、微生物基因組測序組裝、外顯子組基因測序分析、小RNAs序列分析、單細胞全基因組測序等等。目前高通量測序呼聲最響的是在無創產前診斷中的應用。近期我院正著力于高通量測序技術平臺實驗室的創建，高通量測序進入公眾視野指日可待。

為了使高通量測序技術更好地走進臨床，發揮更大的應用價值，應與其它技術更好的結合，如高效的細胞分離和富集技術，全基因組擴增技術。另外，要加快精密型實驗室的建設。此外，高通量測序技術對科研工作者和臨床醫生來說是一個新的領域，在測序過程中產生龐大的數據需依賴于復雜的生物信息學技術分析，這并不是簡單易懂的，為此應該朝著更加簡捷化和自動化發展。最后高通量測序技術作為一種新興的技術，還處在探索前進階段，應朝著更加規范化發展，真正發揮其價值?？傊S著高通量測序技術的臨床開展和各技術環節的日益完善，其必將結出豐碩之果，我們深信基于測序技術的基因數據分析方法將成為主流發展方向，有望改變個性化醫療的前景。

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