廣東省潮州地區(qū)獻血者乙肝感染血清學和分子生物學特征

盧玉香 周筠

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的感染是危害人類健康最嚴重的問題之一，其呈世界性流行，全球約有20億人口感染HBV，其中包括大約2.4億的慢性感染攜帶者，每年約有65萬人死于HBV感染所致的肝功能衰竭、肝硬化和肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）［1］。我國是 HBV 感染中等流行區(qū)，面臨HBV感染的嚴重威脅。2006年全國乙型肝炎血清流行病學調查表明，我國1～59歲一般人群的HbsAg攜帶率為7.18%。據此推算，我國有乙肝感染者約9 300萬人，其中慢性乙肝感染患者約2 000萬［2］。HBV主要經血（如不安全注射等）、母嬰及性接觸傳播。據世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）病毒性肝炎秘書處的報道，通過不安全血制品傳播HBV的風險性極大，可高達70%［3］。為了解潮州地區(qū)無償獻血人群HBV感染血清學和分子生物學特征，為提高輸血安全提供理論和實踐依據，我們對2013至2016年度無償獻血人員HBV感染情況進行分析，結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2013年1月至2016年12月期間在潮州市（湘橋區(qū)、楓溪區(qū)、潮安區(qū)和饒平縣）采集無償獻血者合計35 184人，其中男24 873名，女10 311名，年齡在18～55周歲之間，平均年齡37.5歲。所有研究均獲得潮州市中心血站倫理委員會的批準及參與者的知情同意。

1.2 試劑和儀器

HBsAg酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒［英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司、北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司］；HBV DNA提取試劑盒（磁珠法）（上海浩源生物科技有限公司）；HBV?DNA實時熒光定量PCR試劑盒（上海浩源生物科技有限公司）；HBV基因分型及耐藥突變基因檢測試劑盒（PCR?反向斑點雜交法）［亞能生物技術（深圳）有限公司］；低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；EZbead磁珠法自動核酸提取系統(tǒng)（美國德克薩斯生物基因公司）；ABI 7500熒光定量PCR儀（ABI，美國）；PCR基因擴增儀（杭州博日科技有限公司）；COMBI?H12型分子雜交儀（FINEPCR，韓國）。

1.3 HBsAg檢測及判定

用無抗凝真空管采集35 184名獻血者每人靜脈血3 mL，置于離心機中3 000 r/min離心10 min，分離血清。采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme?linked immunosorbent assay，ELISA）對血清進行HBsAg初復檢，所有操作均嚴格按照說明書進行。按照試劑說明書的標準進行結果判定，規(guī)則如下：（1）樣本OD值S/CO≥1者為HBsAg陽性；樣本OD值S/CO＜1者為HBsAg陰性；（2）陰性對照OD均值＞0.1或陽性對照OD均值≤0.4時，實驗無效，應重新試驗。

1.4 病毒核酸提取

隨機選取上述判定為HBsAg陽性的樣本250例，且樣本無溶血、脂血現象。吸取1 mL血清置于1.5 mL離心管中，-20℃保存；采用磁珠法試劑盒提取HBV?DNA，所有操作均由EZbead磁珠法自動核酸提取系統(tǒng)完成，嚴格按照儀器及試劑說明書進行。

1.5 HBV?DNA實時熒光定量PCR

采用HBV?DNA熒光定量PCR試劑盒檢測各樣本HBV?DNA拷貝數，熒光定量PCR在ABI 7500熒光定量PCR儀上完成。

1.6 HBV基因分型及耐藥性突變基因檢測

隨機從上述DNA樣本中選取73份HBV?DNA＞1 000 IU/mL的DNA樣本，采用PCR?反向點雜交法檢測HBV基因分型及耐藥突變基因。該斑點雜交芯片能同時檢測3種HBV基因型（HBV?B、HBV?C和HBV?D）和HBV拉米夫定耐藥3個常見的突變位點（rt180、rt204和rt207）、HBV阿德福韋酯耐藥2個常見的突變位點（rt181和rt236）。檢測嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0對數據進行統(tǒng)計分析，計量資料采用表示，組間均數比較采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同年度、性別和年齡的獻血者HBsAg陽性率

在35 184份獻血者血液中，824份（2.34%）樣本經ELISA法確證為HBsAg陽性。各年度陽性率分別為2.83%（2013年）、2.28%（2014年）、1.95%（2015年）和2.25%（2016年），年度之間基本呈現平穩(wěn)趨勢；從總體來說，HBsAg陽性檢出率在男性獻血者中（2.56%）明顯高于女性獻血者（1.82%），兩者之間的差異有統(tǒng)計學意義（χ2=17.16，P＜0.01）。將獻血者按照年齡分為5組，每個年齡段的HBsAg陽性率見表2。與獻血人數最多的31～40歲組相比較，21～30歲組和 41～50歲組的 HBsAg陽性率明顯高于31～40歲組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表1 不同年度、性別獻血者HBsAg檢出情況Table 1 HBsAg in blood donors of different years and gender

表2 不同年齡段獻血者HBsAg檢出情況Table 2 HBsAg in blood donors of different age group

2.2 乙肝病毒基因型和耐藥突變的分布

在隨機選擇的250份HBsAg陽性血樣中，經熒光定量PCR篩查出147份HBV?DNA陽性，對其中73份病毒載量＞1 000 IU/mL的樣本進行HBV基因型和耐藥突變分析。此73份樣本分別檢出HBV B基因型64例，占87.7%；HBV C基因型6例，占8.2%；HBV B、C混合基因型3例，占4.1%，未檢出HBV D基因型。HBV B基因型的檢出率明顯高于HBV C基因型，但不同HBV基因型DNA表達量之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表3）。在73份樣本中，僅檢測出HBV拉米夫定耐藥相關突變4例，未檢出任何HBV阿德福韋耐藥相關突變，詳細見表3。

表3 73份樣本的基因型、HBV病毒載量及耐藥突變分布情況比較Table 3 Comparison of genotype，HBV viral load and drug?resistance mutations in 73 samples

3 討論

廣東省從1992年起開始大力推行乙肝疫苗的預防接種工作，經過多年努力，廣東省乙肝防治工作，尤其是兒童乙肝防治工作取得了顯著成效。從廣東省2014～2015年涉及169 211人的乙肝病毒社區(qū)流行病學調查數據可以看出，廣東省的HBsAg陽性率為8.76%，在0～12歲的兒童群體中HBsAg陽性率低至0.29%，在23～59歲的成人群體中HBsAg陽性率高達12.71%，廣東省仍然是乙肝高度流行區(qū)域［4］。由于在無償獻血者中，健康人群所占比例較一般人群高，因此本次潮州地區(qū)的獻血者中HBsAg陽性率2.34%（824/35 184）明顯低于廣東省的一般人群的水平。HBsAg在中國不同地區(qū)的差異明顯，潮州地區(qū)HBsAg陽性率高于海南?。?.29%）［5］、江蘇南京（0.34%）［6］、山東濟南（0.067%）［7］、四川綿陽（1.44%）［8］和哈爾濱（2.1%）［9］。由于至今未見任何潮州地區(qū)成人群體的HBsAg流行病學調查報告，盡管數據可比性差，筆者只能將本研究的數據與1997年倪孟漢等［10］（10.20%），2012 年帥軍等［11］（3.25%）在潮州地區(qū)中小學生中的調查數據做比較。基于根據2014年中國疾病預防控制中心（Chinese Cen?ter For Disease Control And Prevention，CDC）的調查數據［12］，我國人群呈現出年齡越小，HBsAg攜帶率越低的趨勢。本研究對本地成人獻血者的調查數據卻明顯低于本地區(qū)中小學生人群［10?11］，筆者推斷其原因如下：首先，本研究的對象為無償獻血者，有可能是因為近些年無償獻血活動的開展，多次獻血者被淘汰，導致陽性率降低；其次，自從1992年乙肝疫苗預防接種在我國納入免疫規(guī)劃以來，我國乙肝控制取得顯著成效，HBsAg陽性率在人群中逐漸下降［4］。

筆者發(fā)現，潮州男性獻血者HBsAg陽性率顯著高于女性，這一點與我國其他地區(qū)的觀察結果一致［7］。眾所周知，HBV感染是可以通過疫苗來進行預防的，理論上來說男女獻血者之間的HBsAg陽性率應無差異。造成這兩者的之間差異可能是男性的社會活動范圍大于女性，與社會上感染人員接觸機會多，其感染幾率增加［13］。另外，在5個年齡組中，31～40歲組的HBsAg陽性率明顯低于其他4個年齡組（P＜0.05）。筆者認為產生這種差異可能是由于在這個年齡區(qū)段有較多的獻血者是潮州市事業(yè)單位人員（如醫(yī)務人員、教師等），這些人有較強的健康意識和較高的文化水平，因此影響了這個年齡區(qū)段的HBsAg陽性率。

按照HBV全基因序列的異源性，可將其分為A?H共8種基因型，在全球存在一定的地理特征分布。A基因型主要分布在北歐和非洲大陸，B、C 2種基因型主要分布在東亞地區(qū)，D基因型主要分布在中東以及北美地區(qū)，E、F 2種基因型主要分布在南美和非洲地區(qū)，G基因型在法國以及美國常見，而H基因型則主要在美國、墨西哥以及尼加拉瓜地區(qū)［14］。我國南北差異較大，北方地區(qū)以C型為主，南方以B型為主，而西藏和新疆等少數民族聚集地多以D型為主［14］。本研究分析了73份病毒載量＞1 000 IU/mL的樣本的基因型和耐藥突變，本研究的結果提示潮州地區(qū)HBV病毒感染可能是以B型和C型為主，C型的感染可能是導致本地區(qū)HBV感染者肝硬化和肝癌的危險因素。這個結果與2012年陳立華等對本地區(qū)慢性乙肝患者中HBV基因型的調查一致［15］，也與中國大部分HBV基因型為B型和C型的流行病學報道一致［14，16］。

拉米夫定作為乙肝一線抗病毒治療藥物，其主要耐藥機理為HBV DNA聚合酶基因發(fā)生突變［17］，導致與拉米夫定的結合力降低，突變主要分布在B區(qū)和C區(qū)，尤其是C區(qū)YMDD變異最為常見，其主要形式為YIDD或YVDD［17］。在本研究中，雖然絕大多數樣本為野生型（未發(fā)現耐藥突變），但也在3例樣本中檢測出HBV拉米夫定耐藥YVDD突變。HBV耐藥突變多在那些長期使用抗病毒藥物治療的乙肝患者中發(fā)現，但目前對于獻血人群HBV耐藥變異的研究僅有少量報道，這應給予足夠的重視和進一步的研究。

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