乙肝標志物定量測定試劑盒的性能驗證及臨床應用評價

林健聰 王紅翠 吳英松 董志寧 李志雄★

乙型肝炎（hepatitis B）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）引起的全球性流行的傳染性疾病。近年來，世界感染乙型肝炎的人數和因乙型肝炎死亡的人數與日俱增。據世界衛生組織（World Health Organization，WHO）報道，全球約有2.57億乙肝病毒感染者，僅2015年就有88.7萬人死于乙型肝炎導致的并發癥，如肝衰竭、肝硬化和肝細胞癌等。其中，乙型肝炎在世界衛生組織西太平洋區域和非洲區域的成年人口感染率分別為6.2%和6.1%［1］。我國也是乙型肝炎的重災區，據估計全國約有9 300萬人攜帶乙肝病毒，其中慢性乙型肝炎患者約2 000萬例［2］。另外，據2014年全國1～29歲人群乙型肝炎血清流行病學調查結果顯示，1～4歲、5～14歲和15～29歲人群HBsAg流行率分別為0.32%、0.94%和4.38%［3］。

乙型肝炎作為一個極其嚴重的世界衛生問題，能正確、及時地診斷出其感染的情況，對乙型肝炎的預防控制、及早治療和療效觀察具有重要的意義。乙型肝炎病毒血清標志物（hepatitis B virus markers，HBV?M）是診斷乙型肝炎感染和機體免疫狀態的常見標記物［4］，通常包括乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg），乙型肝炎病毒表面抗體（抗HBs）、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）、乙型肝炎病毒e抗體（抗HBe）及乙型肝炎病毒核心抗體（抗HBc），俗稱乙肝五項或乙肝兩對半。

近年來，隨著時間分辨免疫分析、化學發光免疫分析等靈敏度高、線性范圍寬的定量檢測技術的發展，國內的診斷試劑廠商也開始推出關于HBV?M定量檢測的試劑盒。本研究擬根據WS/T 420?2013［5］技術標準的要求，對國產全自動化學發光免疫分析系統配套的HBV?M定量檢測試劑盒進行定量分析性能評估，并與國內外主流的雅培HBV?M全自動磁微粒化學發光試劑盒進行平行比對，以評價國產全自動化學發光HBV?M定量檢測試劑盒的定量分析性能及其臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 標本來源

本研究涉及的標本均來源于廣州軍區廣州總醫院收集的門診患者的血液標本，收集時間段為2016年6月至2016年12月，所有標本均為患者靜脈取血后，經離心分離得到的血清標本，標本放置-20℃儲存。

HBsAg、抗HBs和抗HBc項目的參考物質來源于WHO的國際標準物質，分別為NIBSC Code：12/226（HBsAg），07/164（抗 HBs）和 95/522（抗HBc）。HBeAg和抗HBe項目的參考物質來源于德國 Paul?Ehrlich?Institut研究所的標準物質，分別為 PEI code：129097/12（HBeAg）和 129095/12（抗HBe）。

1.2 儀器與試劑

美國 Abbott Laboratories（以下簡稱“Abbott”）的全自動免疫分析儀ARCHITECT i2000sr及配套的Abbott HBV?M試劑盒、校準品和專用質控品。廈門優邁科醫學儀器有限公司的全自動化學發光免疫分析儀Caris200，配套廣州市達瑞生物技術股份有限公司（以下簡稱“達瑞生物”）的HBV?M定量檢測試劑盒和專用的質控品。

1.3 方法步驟

1.3.1 HBV?M試劑定標

根據Abbott和達瑞生物的HBV?M系列試劑盒的要求，使用定標品進行定標，定標合格后，再進行下一步的檢測操作，且每天進行測試前，測定質控品濃度，保證定標曲線的可靠性。

1.3.2 精密度的驗證

用達瑞生物的HBV?M系列試劑盒，測定其專用的質控品，連續測試5天，每天重復測量3次。計算檢測結果的重復標準差和期間標準差，并與廠家標示的精密度變異系數轉化的標準差進行比對，判斷試劑盒的精密度是否符合要求。

1.3.3 正確度的驗證

本研究采用 WHO 和德國 Paul?Ehrlich?Institut研究所的標準物質作為參考物質，進行正確度驗證實驗。各項目的參考物質共稀釋成3個濃度梯度，且其中濃度值1為試劑盒的臨界值（Cut off值，CO值）。使用達瑞生物的HBV?M系列試劑盒測定不同濃度梯度的參考物質，連續測試5天，每天重復測量2次。計算參考物質的偏移值、偏移驗證區間，并判斷試劑盒的正確度是否符合要求。

1.3.4 線性（測量區間）的驗證

線性（測量區間）驗證的研究，選用接近試劑盒預期測定上限（線性范圍上限）的高濃度標本，再用試劑盒臨界值附近的低濃度標本，稀釋成不同濃度的標本，具體稀釋過程見表1、表2。

表1 HBsAg、HBeAg的線性（測量區間）實驗標本的制備Table 1 Preparation of the linear specimen of HBsAg and HBeAg

表2 抗HBs、抗HBe、抗HBc的線性（測量區間）實驗標本的制備Table 2 Preparation of the linear specimen of Anti?HBs，Anti?HBe and Anti?HBc

線性（測量區間）驗證的標本制備完成后，用達瑞生物對應項目的HBV?M系列試劑盒進行測定，每份樣本重復測定5次，計算均值。根據標本稀釋度和測量濃度均值，作線性回歸圖，并計算相關系數r值和各濃度標本的差異值，要求相關系數r值或其平方R2大于0.995，且各濃度標本的差異值在廠家標示的允許差異百分數（差異限）內。

1.3.5 樣本比對試驗

采用達瑞生物和Abbott的HBV?M系列試劑盒，同步測定 HBsAg、抗 HBs、HBeAg、抗 HBe、抗HBc項目的標本，其中HBsAg的標本133例，抗HBs的標本219例，HBeAg的標本159例，抗HBe的標本163例，抗HBc的標本165例。檢測結束后，統計分析達瑞生物、Abbott 2種HBV?M試劑盒的符合率和測值相關性。

1.3.6 統計學方法

精密度、正確度、線性（測量區間）的驗證，按照 WS/T 420?2013［5］的要求進行統計分析。其他數據采用SPSS18.0軟件進行統計分析，測值的差異性，通過配對t檢驗進行評價，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 精密度的驗證結果

達瑞生物的HBV?M系列試劑盒，廠家標示的重復精密度變異系數為8%，期間精密度變異系數為10%。使用其試劑盒，測定專用的質控品，連續測試5天，每天重復測量3次，得到的總精密度變異系數均不大于8%，其重復標準差（Sr）和期間標準差（Sl）均小于廠家標示精密度變異系數轉化成的重復標準差（σr）和期間標準差（σl），詳見表3。

表3 達瑞生物HBV?M系列試劑盒精密度驗證結果Table 3 The results of precision verification of HBV?M kit

2.2 正確度的驗證結果

使用達瑞生物的HBV?M系列試劑盒測定各項目不同濃度梯度的參考物質，連續測試5天，每天測量2次。參考物質是來源于WHO或德國Paul?Ehrlich?Institut研究所的標準物質，無標示不確定度，故將參考物質測量偏移值的驗證區間與參考物質的賦值進行對比，對比結果顯示，參考物質的賦值在偏移值的驗證區間范圍內，表明廠家標示的HBV?M系列試劑盒的正確度可靠，詳見表4。偏移值的驗證區間根據 WS/T 420?2013［4］中8.3.6.3.2的公式進行計算，其中參考物質無標示測量標準的不確定度，設定為0。

表4 達瑞生物HBV?M系列試劑盒正確度驗證結果Table 4 The results of correct verification of HBV?M kit

2.3 線性（測量區間）的驗證結果

按表1、表2的方法，配制各項目線性（測量區間）驗證實驗的標本，再用對應項目的達瑞生物的HBV?M系列試劑盒進行測定，重復測定5次，計算均值。以標本的稀釋度為橫坐標、測定濃度的均值為縱坐標繪制線性回歸圖，詳見圖1。其中，HBsAg項目的線性回歸方程為：y=236.1x+1.059，R2=0.998；抗HBs項目的線性回歸方程為y=908.1x+14.93，R2=0.997；HBeAg項目的線性回歸方程為：y=131.2x+0.418，R2=0.999；抗HBe項目的線性回歸方程為y=16.87x+0.779，R2=0.997；抗HBc項目的線性回歸方程為y=17.59x+1.116，R2=0.997。各項目的線性回歸相關系數R2，均大于0.995。另外，再根據公式差異百分數（%）=（測定濃度均值?理論濃度）/理論濃度×100%，統計試劑盒測定不同濃度標本的差異百分數，詳見表5。

2.4 樣本比對的陰陽性檢測結果

使用達瑞生物和Abbott的HBV?M系列試劑盒，同步測定 HBsAg、抗 HBs、HBeAg、抗 HBe、抗HBc項目的標本。其中，HBsAg項目，達瑞公司和Abbott的總符合率為99.25%；抗HBs項目，達瑞公司和Abbott的總符合率為98.63%；HBeAg項目，達瑞公司和Abbott的總符合率為100%；抗HBe項目，達瑞公司和Abbott的總符合率為98.77%；抗HBc項目，達瑞公司和Abbott的總符合率為100%，統計結果詳見表6、表7。

圖1 達瑞生物HBV?M系列試劑盒線性（測量區間）驗證的線性回歸圖Figure 1 Linear regression diagram of linear verification of HBV?M kit

2.5 樣本比對的測值相關性分析結果

Abbott的HBV?M試劑盒中，HBsAg和抗HBs項目的試劑盒是定量試劑，將達瑞生物試劑的測值與其進行測值相關性的評價。使用SPSS 18.0的軟件進行統計分析，以達瑞生物試劑盒的檢測結果為橫坐標，Abbott試劑盒的測值為縱坐標，對HBsAg、抗HBs的標本檢測結果進行相關性分析。HBsAg的相關性系數R2值為0.973，線性回歸方程為y=0.981x?28.91，兩者的檢測結果無顯著性差異（P＞0.05）；抗HBs的相關性系數R2值為0.979，線性回歸方程為 y=1.016x?3.254，兩者的檢測結果無顯著性差異（P＞0.05），分析結果見圖2、表8、表9。

2.6 差異樣本的結果分析

達瑞公司和Abbott的HBV?M試劑盒對比，有部分標本的陰陽性判斷不一致，使用Roche對應項目的試劑盒進行檢測，其中HBsAg、抗HBe項目的檢測結果與達瑞生物的一致，且Abbott均為弱陽性測值；抗HBs項目的檢測結果，1例與達瑞生物的測值一致，2例與Abbott的測值一致，詳細結果見表10。

表5 達瑞生物HBV?M系列試劑盒線性（測量區間）驗證的結果Table 5 The results of linear verification of HBV?M kit

3 討論

HBV?M是HBV感染機體后，在體內產生的一系列反映病毒感染狀態和機體免疫狀態的標志物。其定性檢測始于80年代中期，對乙型肝炎的疾病診斷、病程監測、療效觀察等起到了一定的作用［6］。隨著定量檢測技術的發展，科學家們對HBV?M定量檢測的研究越來越多，其臨床意義及臨床指導作用也越來越明確［7］。據李金明教授等［8］的介紹，HBV?M 的定性檢測和定量檢測，其應用目的不同，前者主要用于分析患者HBV感染狀態，后者則主要用于抗病毒藥物治療的療效預測和評估，特別是針對慢性乙型肝炎的治療。如監控HBsAg的濃度，可評價抗病毒藥物的治療效果和間接反映體內HBV復制的活躍程度等；檢測抗HBs的濃度，可反映出機體對HBV抵抗能力的強弱；監控HBeAg的濃度，可判斷慢性乙肝病毒攜帶者是否發病、預測抗病毒治療的效果、判斷抗病毒治療的終點等［9］；測定抗HBe的濃度，可以對慢性乙肝抗HBe定量持續很高的患者進行密切觀察，及時給予干預性治療，避免疾病的加重；測定病人的抗HBc含量，可對HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者的聚乙二醇干擾素和核苷（酸）類似物治療有一定的預測價值［3］。

表6 HBV?M系列試劑盒標本檢測結果統計表Table 6 The results of specimen of HBV?M kit

表7 達瑞生物與Abbott HBV?M系列試劑盒符合率結果統計表（%）Table 7 The results of coincidence rate of Darui biotechnology and Abbott HBV?M kit（%）

圖2 標本測值相關性分析散點圖Figure 2 The scatter plot of correlation analysis

表8 HBsAg標本測值配對t檢驗結果Table 8 The results of t?test pairs of HBsAg

表9 抗HBs標本測值配對t檢驗結果Table 9 The results of t?test pairs of Anti?HBs

表10 差異樣本的檢測結果Table 10 The review results of the inconsistant samples

為了滿足市場對HBV定量檢測的需求，國內越來越多的體外診斷試劑廠家推出相關的試劑產品，試劑的性能參差不齊。對此，本研究選用WS/T 420?2013［5］的標準方法，對達瑞生物的 HBV?M 定量檢測試劑盒的定量檢測性能進行了驗證。驗證結果顯示，達瑞生物的HBV?M定量檢測試劑盒的重復精密度和期間精密度均小于廠家標示的重復精密度和期間精密度；正確度驗證中，參考物質的賦值均處于偏移值的驗證區間內；線性（測量）區間的驗證實驗中，各項目的線性回歸相關系數R2為0.997～0.999，均大于0.995，且不同濃度標本的差異百分數均不大于20%，符合廠家標示的允許差異百分數。根據 WS/T 420?2013［5］的要求可判斷，達瑞生物的HBV?M定量檢測試劑盒的定量分析性能是可靠的。本研究還對達瑞生物與Abbott的HBV?M試劑盒檢測臨床樣本的性能進行了對比，結果顯示，達瑞生物的 HBsAg、抗 HBs、HBeAg、抗HBe和抗HBc定量檢測試劑盒與Abbott相應試劑盒的陰陽性總符合率分別為99.25%、98.63%、100.00%、98.77%、100.00%，說明2種試劑在檢測HBV?M時的符合性很高。此外，Abbott只有HBsAg、抗HBs項目可以進行定量檢測，達瑞生物和Abbott的該項目測值相關系數R2值分別為0.973、0.979，經過配對t檢驗，兩者的檢測結果無顯著性差異（P＞0.05），這說明了2種試劑的測值具有很高的一致性，檢測結果具有互通性。據謝而付等［10］的研究顯示，Abbott和Roche 2種分析系統在測定HBV?M時，具有一定的檢測符合率和相關性，而楊凡等［11］則報道了Roche和LIASON化學發光分析系統的HBV?M檢測結果具有很高的一致性。這說明了進口的化學發光分析系統在檢測HBV?M技術方面，是比較穩定的。而本研究通過達瑞生物與Abbott的HBV?M試劑盒的對比，探討了國產HBV?M化學發光試劑與進口試劑的性能差距，期望能為國產HBV?M化學發光試劑的發展提出一些想法。

通過對2種試劑檢測結果不一致的樣本進行分析，其中抗HBs的檢測結果最復雜，達瑞生物、Abbott和Roche等3種試劑盒對3份標本的檢測結果不完全一致，該情況與謝而付等［10］的研究結果相符。原因可能是不同的試劑在檢測抗HBs時，由于不同廠家使用的活性原料不同、抗HBs產生的原因不同，而導致不同廠家的試劑盒對其反應性存在差異［12］。故抗HBs的陰陽判斷，可參考國際上通用的方法，使用多家試劑進行標定，同時結合其他4項HBV?M項目的檢出結果進行判斷［13］。

目前，Abbott、Roche等進口的免疫發光分析系統在國內臨床上得到廣泛的應用。在提倡減輕患者負擔、檢驗結果互認的情況下，國內新興的化學發光免疫檢測試劑，應與廣泛運用的Abbott、Roche等試劑進行對比，并保證較高的符合率和測值相關性。本研究初步驗證了達瑞生物HBV?M定量檢測試劑盒可靠的定量分析性能，且與Abbott同類試劑的對比，具有較高的符合率和測值相關性，因此臨床應用價值較高。此外，抗HBs在結果判斷，也應引起重視，避免不同試劑測值不一致而難以進行判斷的情況。

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