結直腸癌患者血漿中可溶性血栓調節蛋白的水平及其臨床意義

白駒 楊力芳

隨著人口老齡化的加重和生活方式的變化，中國結直腸癌的發生率和死亡率逐年攀升，到2015年止，結直腸癌在中國城市癌癥發病率中位居第三位，死亡率位居第四位［1?2］，嚴重影響人類的生命健康。如何有效評估患者病情并明確其發生發展機制是臨床及基礎工作中面臨的首要問題。可溶性血栓調節蛋白（soluble thrombomodulin，sTM）是一種存在于血管內皮細胞表面的糖蛋白，在血管內皮受損傷后可快速釋放入血，可作為檢測血管內皮損傷的標志物［3］。近年來許多研究顯示，sTM與急性淋巴細胞白血病、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤存在密切關系［4?5］，本研究旨在通過檢測結直腸癌患者血漿中sTM水平及其在不同發展階段的變化，探討其在結直腸癌中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

觀察對象為中南大學湘雅醫院2014年1月至2016年9月普外科收治的60例結直腸癌患者，年齡在37～69歲，平均51歲，其他基本情況見表1。表1中的高惡性指病理檢查結果為低分化的腺癌，TNM分期根據國際抗癌聯盟（International Union Against Cancer，UICC）和美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）合作制定的第 7版腫瘤TNM分期［6］。體檢中心60例正常成人，其中男性35人，女性25人，年齡在37～70歲，平均年齡54歲；活動期潰瘍性結腸炎患者20例，男性12例，女性8例，年齡在31～64歲，平均46歲。3組患者男女比例及年齡無顯著差異（P＞0.05），具有可比性。所有結直腸癌患者均為首次發現結直腸癌，入院前未經過任何抗癌治療，且不合并其他影響凝血功能的疾病，以及其他器質性疾病。

1.2 檢測方法

采用酶聯免疫吸附法（enzyme?linked immuno?sorbent assay，ELISA）檢測3組觀察對象血漿中sTM水平，所用試劑盒由法國Dignosticastago公司提供，取患者入院后2 h以內及治療后1～2周的靜脈血2 mL，體檢中心單次采血2 mL，分裝1 mL于抗凝管中，輕搖后，4℃3000r/min離心10 min，-80℃保存待測。檢測時按試劑盒說明書操作。

表1 結直腸癌患者臨床病理資料Table 1 Clinical pathological data of colorectal cancer patients

1.3 治療方法

術前 PET?CT（positron emission tomography?CT）評估TNM分期，采用以手術為主的綜合治療原則，根據患者全身狀況和各個器官的功能狀態、腫瘤的位置、分期、病理類型等決定綜合治療措施。所有患者均行手術治療，手術方法：患者于術前行纖維結腸鏡檢查，觀察原發灶情況，在距腫瘤緣10 cm結扎腫瘤兩側腸管，腔內注入30 mg/kg的5?氟尿嘧啶，離斷腸系膜血管行根部淋巴結清掃術，腸道重建并縫合切口，放置引流管，關閉腹腔。其中39例Ⅲ期及Ⅳ期患者采用5?氟尿嘧啶（375 mg/m2）聯合亞葉酸鈣（20 mg/m2）的輔助化療方案，療程總時長6個月。患者每2個月定期復查血漿sTM水平，中途丟失的病例以最近一次檢測結果代替。

1.4 統計分析

采用SPSS 19.0統計分析軟件，計量資料采用平均數±標準差（±s）表示，方差分析比較檢查結果，P＜0.05為差異具有統計學意義，兩兩比較采用SNK法，sTM與TNM分期之間相關性分析采用Spearman相關分析。

2 結果

2.1 腫瘤組患者sTM的變化趨勢

比較結直腸癌患者治療過程中sTM水平的變化情況，結果顯示，術后2月及以后，單純手術組患者及手術聯合化療治療的患者的sTM水平均出現顯著下降（P＜0.05），手術聯合化療組在術后第2月時的sTM水平顯著低于單純手術組的sTM水平（P＜0.05），在術后第4月及第6月時差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 腫瘤組患者在治療過程中sTM水平的變化情況（±s，ng/mL）Table 2 The change of sTM level in the tumor group during treatment（±s，ng/mL）

表2 腫瘤組患者在治療過程中sTM水平的變化情況（±s，ng/mL）Table 2 The change of sTM level in the tumor group during treatment（±s，ng/mL）

相比術前*P＜0.05，**P＜0.01，相比單純手術▲P＜0.05。

組別單純手術組手術聯合化療組n 21 39術前69.7±13.9 73.8±12.3術后1天70.7±11.6 72.8±15.8術后2月59.1±10.4*54.5± 12.6*▲術后4月50.6±8.3**53.9±7.1**術后6月43.9±7.5**48.4±8.7**

2.2 治療前腫瘤組、潰瘍組及正常組sTM水平比較

比較結直腸癌患者治療前與潰瘍組及正常組sTM水平之間的差異，結果顯示，腫瘤組血漿中sTM 水平為（70.4±14.5）ng/mL，顯著高于潰瘍組（36.9±8.6）ng/mL及正常組（31.7±7.3）ng/mL，差異有統計學意義（總F值為17.14，兩兩比較結果分別為P＜0.05，P＜0.01）。潰瘍組sTM水平顯著高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組血漿sTM表達水平比較Figure 1 Comparison of plasma sTM expression between each groups

2.3 腫瘤組TNM分期與sTM水平的關系

從表3結果可以看出，隨著患者TNM分期的升高，sTM水平逐漸上升，組間差異具有統計學意義（P＜0.001），且Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者與正常組差異具有統計學意義（P＜0.05），Ⅰ期患者與正常組差異無統計學意義（P＞0.05）。Spearman相關性分析的結果顯示，結直腸癌患者TNM分期與sTM水平呈正相關（rs=0.675，P＜0.05）。

表3 正常組及腫瘤組不同TNM分期的患者sTM水平Table 3 The sTM levels of the patients in the normal groupand tumor group with different TNM stages

2.4 治療前后結直腸癌患者sTM水平的變化

隨訪6個月后檢測患者血漿中sTM水平，結果顯示，行單純手術治療的患者治療后sTM水平（43.9±7.5）ng/mL，手術聯合輔助化療的患者治療后sTM水平（48.4±8.7）ng/mL，顯著低于治療前（70.4±14.5）ng/mL，差異有統計學意義（總F值為9.38，兩兩比較結果均為P＜0.05）。單純手術患者與手術聯合輔助化療患者sTM水平差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

3 討論

圖2 治療前后結直腸癌患者血漿sTM表達水平比較Figure 2 Comparison of plasma sTM levels in patients before and after treatment

sTM是存在于血管內皮細胞膜上的跨膜糖蛋白，生理情況下僅有少量由內皮細胞膜表面水解游離于血漿中。當內皮細胞大量受損時，其在血漿中的含量就會明顯升高，因此sTM可作為反映內皮細胞損傷的標志物之一。惡性腫瘤的轉移是導致患者死亡的主要原因，其發生過程主要經過局部浸潤，侵入血管內皮進入循環系統，隨血液循環系統轉移并在血管中存活、移出，在轉移部位定植。腫瘤細胞由原發部位浸潤侵入循環系統后，作為游離的微轉移灶是十分脆弱的，它們的轉移潛力很大程度上取決于逃避免疫系統的能力和穿透血管內皮屏障的能力，然而目前其穿透血管內皮屏障的機制尚不完全明確。有許多研究報道，惡性腫瘤可通過多種途徑損傷內皮細胞的結構和功能，以促進游離的腫瘤細胞定植，如研究顯示，體內和體外的腫瘤細胞均能通過上調NF?κB和JNK通路及caspase?8?FLIPL 通路等［7?11］，促進淀粉樣前體蛋白和其死亡受體?6（death receptor 6，DR?6）的表達，誘導內皮細胞壞死［12］，促進腫瘤細胞的外滲和轉移。Thuringer等［13］的研究顯示，結直腸癌細胞可通過影響毛細血管內皮細胞的緊密連接，使得內皮細胞功能發生障礙，有利于腫瘤細胞的遷移。sTM水平的上調可能是由于惡性腫瘤致內皮細胞損傷使血栓調節蛋白（thrombomodulin，TM）釋放入血所致。Hagag等［4］也在其研究中發現在急性淋巴細胞白血病患兒中持續高水平的sTM預示著不良預后。同時，Liu等［5］在其體外實驗中發現干擾非小細胞肺癌A549細胞的TM的表達可顯著增強細胞的侵襲轉移能力；Wu等［14］在研究中發現抑制膀胱癌細胞TM的表達可促進腫瘤細胞的增殖及上皮間充質轉化（epithelial?mesenchymal transition，EMT）過程的發生，并可促進血管生成；Zheng等［15］發現TM在非小細胞肺癌中可引起細胞G1期阻滯的發生和顯著降低細胞克隆形成的能力，同時可顯著升高鈣粘附蛋白E（E?cadherin）的表達，促進細胞間黏附作用，逆轉EMT的過程。綜上，sTM可能作為一種血管保護因子或腫瘤抑制因子，在體內發揮著拮抗腫瘤細胞侵襲轉移的作用。

本研究顯示，結直腸癌患者血漿sTM水平顯著高于活動期潰瘍性結腸炎患者及正常人群，姜齊宏等［16］也在結直腸癌患者血清中發現血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的升高，推測結直腸癌的發生發展可能對血管內皮細胞產生損傷。進一步對結直腸癌患者各個TNM分期的人群與正常人群的血漿sTM水平比較，結果發現，Ⅰ期患者與正常人群差異無統計學意義，提示未發生淋巴結轉移或遠處轉移的結直腸癌患者，可能由于血管內皮細胞無明顯損傷，sTM水平差異不顯著。然而Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者出現局部淋巴結轉移或遠處轉移，血管內皮細胞出現不同程度的損傷，sTM水平隨之升高。Spearman相關性分析的結果顯示TNM分期的級別與患者血漿sTM水平呈正相關，進一步證實了結直腸癌發生發展與sTM的密切關系。手術或聯合化療治療后，患者sTM水平也隨之降低，推測是由于癌細胞進展的控制，血管內皮細胞損傷減輕所致。單純手術患者治療后第2個月的sTM水平顯著高于手術聯合化療組，推測可能的原因是由于手術聯合化療藥物的短期療效優于單純手術，但第6個月后單純手術患者sTM水平略低于手術聯合化療組，可能是因為手術聯合化療組患者本身來源于Ⅲ、Ⅳ期結直腸癌患者，病情較重，即使短期控制效果優于單純手術組，但長遠療效低于單純手術組。鄭娜娜［17］在其研究中發現TM可抑制肺癌細胞的成瘤能力及遷移作用，是潛在的抑癌蛋白。基于sTM與結直腸癌病情嚴重程度的密切關系以及上述已有的研究，推測sTM可能通過促進細胞間的緊密連接，實現對抗結直腸癌細胞侵襲轉移的過程，以及對腫瘤EMT過程的逆轉，實現對結直腸癌細胞分子分型的影響。

本研究對sTM在不同情況下結直腸癌患者血漿中的表達水平進行了探究，但sTM在結直腸癌的侵襲轉移過程中的作用并不明確，筆者擬進一步通過體內體外實驗對其確切作用進行探究，進一步挖掘sTM在臨床和基礎工作中的潛在價值。綜上所述，sTM不僅能夠有效地反映結直腸癌的發生發展情況，也為明確結直腸癌發生侵襲轉移的機制提供了線索，是潛在的腫瘤診斷分子標志物。

［1］Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2013［J］.CA Cancer J Clin，2013，63（1）：11?30.

［2］沈琳.重視大腸癌的早期防治［J］.健康指南：醫療保健服務，2016，6（10）：49?50.

［3］Chao TH，Tsai WC，Chen JY，et al.Soluble thrombo?modulin is a paracrine anti?apoptotic factor for vascular endothelial protection［J］.Int J Cardiol，2014，172（2）：340?349.

［4］Hagag AA，Abdel?Lateef AE，Aly R.Prognostic val?ue of plasma levels of thrombomodulin and von Wille?brand factor in Egyptian children with acute lympho?blastic leukemia［J］.J Oncol Pharm Pract，2014，20（5）：356?361.

［5］Liu PL，Tsai JR，Chiu CC，et al.Decreased expres?sion of thrombomodulin is correlated with tumor cell invasiveness and poor prognosis in non small cell lung cancer［J］.MolCarcinog，2010，49（10）：874?881.

［6］薛衛成，顧晉.第7版結直腸癌TNM分期（2010）的變化及意義［J］.中華外科雜志，2010，48（21）：1605?1606.

［7］Silke J，Rickard J A，Gerlic M.Erratum：The diverse role of RIP kinases in necroptosis and inflammation［J］.Nat Immunol，2015，16（7）：689?697.

［8］Oberst A，Dillon CP，Weinlich R，et al.Catalytic ac?tivity of the caspase?8?FLIP（L）complex inhibits RIPK3 ?dependent necrosis［J］.Nature，2011，471（7338）：363?367.

［9］Kaiser WJ，Upton JW，Long AB，et al.RIP3 medi?ates the embryonic lethality of caspase?8?deficient mice［J］.Nature，2011，471（7338）：368?372.

［10］Pan G，Bauer JH，Haridas V，et al.Identification and functional characterization of DR6，a novel death do?main?containing TNF receptor［J］.Febs Letters，1998，431（3）：351?356.

［11］Galluzzi L，Bravo?San Pedro JM，Vitale I，et al.Es?sential versus accessory aspects of cell death：recom?mendations of the NCCD 2015［J］.Cell Death Differ，2015，22（1）：58?73.

［12］Strilic B，Yang L，Albarránjuárez J，et al.Tumour?cell?induced endothelial cell necroptosis via death re?ceptor 6 promotes metastasis［J］.Nature，2016，536（7615）：215?218.

［13］Thuringer D，Berthenet K，Cronier L，et al.Primary tumor?and metastasis?derived colon cancer cells differ?ently modulate connexin expression and function in hu?man capillary endothelial cells［J］.Oncotarget，2015，6（30）：28800?28815.

［14］Wu CT，Chang YH，Lin P，et al.Thrombomodulin expression regulates tumorigenesis in bladder cancer［J］.BMC Cancer，2014，14（1）：1?11.

［15］Zheng N，Huo Z，Zhang B，et al.Thrombomodulin reduces tumorigenic and metastatic potential of lung cancer cells by up?regulation of E?cadherin and down?regulation of N?cadherin expression［J］.BiochemBio?phys Res Commun，2016，476（4）：252?259.

［16］姜齊宏，方向明，陳艷.結直腸癌患者血清中血管內皮生長因子和一氧化氮表達水平及其臨床意義［J］. 內科急危重癥雜志，2012，18（2）：96?97.

［17］鄭娜娜.血栓調節蛋白對肺癌細胞致瘤性和遷移的抑制作用及其機制［D］.蘇州：蘇州大學，2016.