GeXP多重分析技術檢測肝癌組織長鏈非編碼RNA表達的實驗研究

史俊英 王曄 陳文 劉成玉 牟曉峰★

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種常見的嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，其死亡率在所有癌癥中居第二位［1］。臨床上診斷HCC的常用方法有血清學、細胞學、病理學及影像學，但都有一定的局限性和漏檢率［2?3］。隨著精準醫療的迅速發展，高通量技術如各種基因芯片的研發為基因序列測定及發現新的融合基因提供了有利工具，但是其過程繁瑣、成本較高。因此，積極探索有效的診斷及預后標志物是提高HCC患者總生存率和綜合治療水平的有效手段。

長鏈非編碼 RNA（long non?coding RNA，LncRNA）是一類轉錄本長度超過200 nt的無蛋白質編碼功能的RNA，在轉錄及轉錄后調控、表觀遺傳調控等方面調控基因的表達水平［4-5］。近期研究表明，不同LncRNAs在HCC組織中差異表達，有促進或抑制HCC發生發展的作用［6］，為HCC進程及預后評估提供了有利靶點，有望成為臨床應用的新的腫瘤標志物。

GeXP多重基因表達遺傳分析系統是把PCR技術和毛細管電泳分離技術緊密結合在一起，能在同一反應管中對多達35個基因同時進行定量檢測和分析，具有較好的特異性和靈敏度。其在個體化用藥指導，療效與預后評估和病原體鑒定等方面應用廣泛［7］。因此本研究基于GeXP多重基因表達分析系統，建立一種同時在一個反應管中檢測8種Ln?cRNAs的檢測方法，用于探討LncRNA是否可作為HCC的潛在標志物，為其診斷及預后做出積極貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料

收集青島大學第二臨床醫學院2015年7月至2016年12月經影像學檢查或病理組織學確診且術前未經過化療、栓塞、射頻等治療的HCCⅢ期手術切除標本23例，并以癌旁非腫瘤肝組織作為對照，其中男13例，女10例，年齡46～68歲，中位年齡54歲。肝癌診斷及分期符合中國衛生部“原發性肝癌診療規范（2011年版）診斷標準”［8］。本研究經青島大學第二臨床醫學院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器

Trizol試劑購自美國Life Technologies公司，用于RT?PCR的M?MLV第一鏈合成系統試劑盒購自上海Invitrogen公司，GenomeLab GeXP遺傳分析儀、陽性RNA樣品及耗材均購自美國貝克曼公司，熒光定量PCR儀7500和梯度PCR儀Veriti購自美國ABI公司，臺式離心機ST 8R購自美國Thermo公司，超微分光光度計SMA 4000購自北京凱奧公司。

1.3 LncRNA基因與引物設計

檢索并篩選出Pubmed數據庫中近十年間發表的與肝癌有相關報道的LncRNAs，特異性引物設計采用 NCBI Primer Blast，Primer Premier 5.0軟件，并在每對設計好的引物的5′端加入一段通用引物標簽（Tag），并在上游標記熒光染料Cy5（如表1所示）。全部引物合成源于上海Invitrogen公司。

1.4 組織總RNA的提取

采用Trizol法分別提取23對HCC及癌旁組織總RNA，利用超微分光光度計測定總RNA的濃度及純度，樣品合格后置于-80℃保存備用。

1.5 單重RT?PCR法驗證引物

將8種特異性上、下游引物濃度分別稀釋至工作濃度1 μmol/L，陽性RNA樣品稀釋至工作濃度5 ng/μL。以陽性RNA樣品25 ng作為反應模板量，加入終濃度1 μmol/L的單下游引物2 μL，按照上海Invitrogen公司用于RT?PCR的M?MLV第一鏈合成系統試劑盒操作說明書操作來制備cDNA，并于-20℃保存備用。然后建立10 μL的PCR反應體系，依次加入以下試劑：MgCl22 μL，5×PCR buffer 2 μL，單上游引物 1 μL，DNA 聚合酶 0.35 μL，cDNA 4.65 μL。混合均勻后，根據 PCR 結果對反應條件進行優化，最終確定反應條件為：95℃ 10 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，70℃ 1 min，35個循環。隨后，在GeXP樣品板中加入40 μL/孔的 SLS/DSS（80：1）混合液，再加入 PCR 產物1 μL，震蕩混勻10 s，加石蠟油覆蓋樣品。GeXP上機操作過程謹遵GeXP系統軟件說明書進行。

表1 8種LncRNAs引物序列及片段大小Table 1 Primer sequences and fragment sizes of 8 kinds of LncRNAs

1.6 多重反應體系特異性驗證

將8種單個上、下游引物分別取等量進行混合，配制成多重混合引物，使其工作濃度為2 μmol/L，并在多重反應體系中終濃度為200 nmol/L，余下各成分均同單重RT?PCR。

1.7 多重反應體系靈敏性驗證

以23對組織標本提取的總RNA及陽性RNA樣品分別取等量配制成混合模板并梯度稀釋至104、103、102、101拷貝/μL，分別取2 μL做模板，其余反應條件及程序不變，檢測多重反應體系的靈敏度。

1.8 GeXP多重RT?PCR體系對臨床標本的檢測

用已優化好的反應體系分別對23對組織標本進行檢測，以總RNA均為2 μg作為反應模板量進行多重RT?PCR檢測，GeXP系統各基因的表達水平由軟件自行分析并導出計算。

1.9 qPCR驗證

嚴格按照用于RT?PCR的M?MLV第一鏈合成系統試劑盒來制備cDNA。然后在96孔板中建立10 μL反應體系，依次加入以下試劑：10 μmol/L的上、下游單引物各0.5 μL，2×Mastermix 5 μL，10倍稀釋的cDNA 4 μL。最終確定PCR反應條件為：95℃ 3 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，此處收集熒光信號（40個循環）。以GAPDH作為反應內參，采用 2?ΔΔC（t）法計算肝癌及癌旁組織中各 LncRNA 基因相對表達水平。

1.10 統計學方法

應用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，以均數±標準差（±s）表示定量資料。采用配對樣本t檢驗進行統計學分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GeXP系統引物特異性驗證結果

單重PCR產物經GeXP系統分析儀分析后，各靶基因擴增片段分別在如下區間出現擴增產物：GAS5：155.11～157.90 bp；NEAT1：165.21～168.67 bp；H19：186.47～189.81 bp；MALAT1：196.68～199.64 bp；HOTAIR：205.33～208.77 bp；DANCR：226.05～228.98 bp；UCA1：236.75～238.58 bp；BCAR4：246.57～248.97 bp。實際擴增片段和和理論片段大小有±2 bp的差異不影響對結果的判斷，因此這8種LncRNAs擴增片段大小與設計相符。多重RT?PCR中可擴增出各引物的特異性片段，無交叉反應，提示該方法引物特異性良好，可根據片段大小來區分這8種LncRNAs（圖1）。

圖1 GeXP多重RT?PCR體系特異性分析Figure 1 The specificity analysis of GeXP multiplex RT?PCR system

2.2 多重反應體系靈敏度驗證結果

圖2 GeXP多重RT?PCR體系靈敏度分析Figure 2 The sensitivity analysis of GeXP multiplex RT?PCR system

優化反應條件后，多重檢測體系可在104、103、102、101拷貝/μL水平同時檢測出混合模板的8種LncRNAs，證實靈敏度良好（圖2）。

2.3 GeXP多重分析技術對臨床標本的檢測結果

由表2可見，利用GeXP多重分析技術分別在23對肝癌和癌旁組織中檢測出了8種LncRNAs的差異表達。與癌旁對照組比較，肝癌組織中NEAT1、H19、MALAT1、HOTAIR、DANCR、UCA1、BCAR4的表達量顯著下降（P均＜0.05）；LncRNAGAS5的表達量顯著上升（P＜0.05）。

2.4 qPCR對臨床標本的檢測結果

由圖 3 可知，利用 2?ΔΔC（t）法來計算 HCC及癌旁組織中8種LncRNAs基因相對表達水平。與癌旁組織比較，HCC組織中NEAT1、H19、MALAT1、HOTAIR、DANCR、UCA1、BCAR4的相對表達量顯著下降（t值分別為?2.253，?2.185，?2.385，?2.759，?2.448，?2.097，?2.148，P均＜0.05）；肝癌組織中LncRNAGAS5的相對表達量顯著上升（t值為 2.450，P＜0.05）。qPCR 結果與 GeXP多重RT?PCR結果相符。

3 討論

HCC起病隱匿，早診率低，大多數患者在確診時已屬晚期或者發生遠處轉移，錯過手術或治療最佳時機。甲胎蛋白作為傳統的血清學診斷之

一，廣泛應用于臨床，但靈敏性及特異性受限，而且在一些肝炎、肝硬化、妊娠女性中其含量也會升高［3］。雖然有新的標志物被陸續發現并應用于臨床（如：高爾基體蛋白、磷脂酰肌醇蛋白聚糖?3、熱休克蛋白等），但其都屬于蛋白水平的檢測，影響因素較多。高通量技術過程繁瑣而且價格昂貴，外周血循環腫瘤細胞檢測所用血量有限且早診率低。GeXP多重RT?PCR技術可同時對多個基因進行定量檢測和分析，特異性和靈敏度良好，在個體化用藥指導、療效及預后評估、遺傳病及癌基因的分型鑒定等方面應用廣泛［7］，為腫瘤的診斷、分型及預后評估方面具有重要的臨床價值。

表2 GeXP實驗對8種LncRNAs表達水平的檢測（n=23，±s）Table 2 The expression level of 8 kinds of LncRNAs detected in GeXP assay(n=23,±s)

表2 GeXP實驗對8種LncRNAs表達水平的檢測（n=23，±s）Table 2 The expression level of 8 kinds of LncRNAs detected in GeXP assay(n=23,±s)

LncRNA GAS5 NEAT1 H19 MALAT1 HOTAIR DANCR UCA1 BCAR4肝癌99 501.00±50 438.65 55 381.78±2 549.70 17 958.48±6 166.25 76 486.91±18 072.57 32 342.13±1 678.59 19 897.61±12 239.23 22 168.57±11 317.70 27 717.39±15 351.01癌旁57 706.00±42 940.10 65 622.74±22 641.08 29 035.74±15 102.35 97 046.50±24 958.21 43 280.78±23 778.05 28 290.87±12 877.85 33 425.65±12 097.59 35 647.65±10 604.61 tP 3.714-2.394-3.163-3.661-2.257-2.467-3.490-2.271 0.001 0.026 0.005 0..001 0.034 0.022 0.002 0.033

圖3 qPCR檢測對23對臨床標本中8種LncRNAs的相對表達量Figure 3 The relative expression of 8 LncRNAs in 23 pairs of clinical specimens was detected in qPCR

LncRNA是哺乳動物轉錄組的一個重要組成部分，影響基因的表達水平，調控細胞的增殖、轉移和預后進程［9］。有研究報道，GAS5在大多數晚期肝癌組織中表達下降［10］，而NEAT1在肝癌組織中表達上升，與腫瘤結節的數量、遠處轉移、血管侵犯等相關［11］。LncRNAH19是一類由印跡基因編碼，在胚胎發育期高表達，出生后大多數組織中低表達的LncRNA［12］，在胃癌、膀胱癌等腫瘤中發揮癌基因的作用，在肝癌和前列腺癌中卻發揮抑癌基因的作用，其低表達與肝癌的不良預后呈正相關［13］。MALAT?1是在轉移性非小細胞肺癌中利用減除雜交法第一次鑒定到的另一種LncRNA［14］，可以預測肝移植后肝癌的復發和無病生存期的長短［15］。HOTAIR是第一個以反式轉錄調控方式對靶基因進行調控的LncRNA，是判斷肝癌患者瘤體的大小和復發的生物指標［16］，且高表達的HOTAIR與肝癌的分化、轉移及早期復發密切相關［17?18］。Yuan 等［19］最早在肝癌中發現DANCR，其在干細胞樣HCC細胞中過表達，并且可作為HCC患者的預后生物標志物。Wang等［20］首先在膀胱癌中檢出高表達的LncRNAUCA1，后來Wang等發現UCA1在HCC組織中的表達顯著上調，并且與TNM分期、轉移和術后生存期相關［21］。BCAR4首先在人乳腺癌的耐藥過程中被發現［22］，最新研究發現非小細胞肺癌患者BCAR4水平高表達者，其預后較差［23］。總之，LncRNA在包括HCC的各種腫瘤進程中扮演著重要作用，對于差異表達的LncRNAs，進一步可以用siRNAs干涉或導入過表達載體后檢測其基因表達，以確證基因調節通路，為HCC的治療提供一種潛在的治療措施。

利用GeXP多重基因表達遺傳分析系統，Zeng等［24］建立了一種同時檢測8種免疫抑制性雞病毒的方法，Wang等［25］對患社區獲得性肺炎的住院兒童合并感染的多種病毒進行檢測，為兒科病毒感染的檢測提供了有利工具。本研究建立了一種能同時檢測人HCC相關的8種LncRNAs的方法，與qPCR方法比較，所需時間短，可以在單管中快速、高效地對1 ng～5 μg的總RNA做出檢測并且靈敏度及特異性良好。但本方法與何玢等［26］的研究均存在人為誤差、小的雜峰等不足之處，但一般不會影響對結果的判定。此外，RNA不穩定易降解，需要操作人員認真操作，妥善保存樣本及試劑并避免反復凍融。另外，本研究所采取標本均為肝癌Ⅲ期手術標本，由于個體差異和標本量的局限性，各LncRNAs的表達量差異較大，仍需大量的臨床標本進一步驗證反應體系及統計臨床結果。總之，本研究建立的GeXP多重檢測體系可以作為一種有效、快捷且特異的檢測與HCC有關的LncRNAs的新方法，為HCC的診斷及預后奠定了一定的方法學基礎。

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