兒童社區獲得性肺炎不同臨床類型外周血β-防御素1水平的表達

劉開云， 劉 歡， 張 融， 馬愛寧

人β-防御素（HBD）是近些年來發現的一類 極為重要的內源性抗微生物肽，其抗感染功能正逐漸被臨床所認識[1]，被認為是抵抗病原微生物侵襲的第一道化學屏障[2-3]，HBD有HBD-1、HBD-2和HBD-3等亞型，其表達可能因感染類型和感染部位而異。雖然對HBD-1在各種感染性疾病中的研究日益深入，但對其在兒童感染性疾病中的研究甚少。兒童社區獲得性肺炎（CAP）是小兒呼吸系統最常見的感染性疾病之一，通過對兒童CAP不同臨床類型外周血中HBD-1表達水平的研究，探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 資料來源

2015年2－10月于我院兒科住院的CAP患兒共122例，均符合CAP的診斷標準：發熱、咳嗽、呼吸頻率增快、呼吸困難、胸壁吸氣性凹陷、肺部濕啰音和管狀呼吸音等，胸部X線片異常表現包括肺紋理增多增粗、肺部斑片狀模糊影、肺實變、肺不張、胸腔積液等，均符合兒童CAP臨床表現及影像學特征[4]為CAP組，其中男83例（68.0%），女39例（32.0%）。對照組52例，為同期本院兒外科因腹股溝疝、包莖、精索囊腫等非感染性疾病而擇期手術入院的患兒。其中男41例（78.8%），女11例（21.2%）。CAP組與對照組在性別及年齡上無差異。經本院醫學倫理委員會批準實施，所有患兒的家屬均同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 相關檢查 所有CAP患兒入院后按診療常規進行相關指標檢查：病原學檢查、C反應蛋白（CRP）、血常規及X線胸片（或胸部低通量CT）。根據病原學將CAP分組為病毒性肺炎41例，細菌性肺炎35例，肺炎支原體或肺炎衣原體肺炎46例。根據臨床表現將CAP分組為重度肺炎39例，普通肺炎83例。臨床表現為胸壁吸氣性凹陷、鼻翼扇動、呻吟、中心性紫紺、嚴重呼吸窘迫、拒食或脫水癥、意識障礙之一者診斷為重度肺炎[4]，否則為輕度肺炎。CAP患兒按年齡段分：≤6月齡31例，＞6～12月齡32例，＞12～36月齡33例，＞36月齡26例。對照組患兒血清均來自術前常規檢查的標本。所有患兒入院后將血清置于-80?℃保存，以備HBD-1檢測。

1.2.2 血清中HBD-1測定 使用南京建成生物有限公司生產的HBD-1試劑盒，用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測患兒血清中HBD-1水平，使用生化儀提取總蛋白，然后采用雙縮脲法測定，均在自動生化分析儀上進行， 每次測定均嚴格進行質控品的同步檢測。標準血清HBD-1濃度測定均嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作進行。根據標準曲線及不同樣品的總蛋白濃度進行歸一化處理后得到標準血清HBD-1蛋白濃度。

試驗應用雙抗體夾心法測定血清中HBD-1水平：準備試劑、標準血清和標準品，加入準備好的標準血清和標準品，37?℃反應30 min；洗板5次，加入酶標試劑，37?℃反應30 min；洗板5次，加入顯色液A、B，37?℃顯色10 min；加入終止液，15 min之內用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（D值），通過標準曲線計算標準血清中人HBD-1濃度（μg/L）。

1.2.3 呼吸道病毒檢測 使用北京貝爾生物工程有限公司生產的系列呼吸道病毒檢測試劑盒，包括人呼吸道合胞病毒、人副流感病毒、腺病毒、A型流感病毒、B型流感病毒IgM抗體檢測試劑盒，用ELISA體外定性檢測患兒血清中的呼吸道病毒IgM抗體。

1.2.4 肺炎支原體、肺炎衣原體抗體檢測 使用深圳市安群生物工程有限公司生產的肺炎支原體、肺炎衣原體IgM抗體檢測試劑盒，用ELISA定性檢測患兒血清中的肺炎支原體IgM抗體及肺炎衣原體IgM抗體。

1.2.5 痰培養留取 在抗菌藥物使用前，用彎壓舌板向后壓舌，將棉拭子伸入咽部，患兒經壓舌刺激咳嗽時，可噴出肺部或氣管分泌物粘在拭子上。將棉拭子密封，立即送至檢驗科微生物室接種培養。

1.2.6 統計學分析 本次研究所得數據采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析，非正態連續變量用中位數（四分位數間距）表示；計量資料以均數±標準差表示；兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用F檢驗；分類資料組間比較用卡方檢驗；相關性分析用Pearson法。統計顯著水平為P＜0.05。

2 結果

2.1CAP組與對照組比較

兩組在性別和年齡上無差異（P＞0.05），兩組HBD-1濃度有顯著差異（P＜0.05），見表1。

2.2 不同病原體感染

病毒、細菌及肺炎支原體或肺炎衣原體組的CAP組與對照組之間HBD-1水平比較顯示：各組在性別上無差異，在年齡上細菌組、肺炎支原體或肺炎衣原體組與病毒組、對照組有差異；不同病原體感染CAP兩兩之間HBD-1水平比較無顯著差異（P＞0.05）；而對照組HBD-1水平低于各病原體組（F=7.719，P＜0.05），見表2。

表1 CAP組與對照組HBD-1比較Table 1 Serum human β-defensin 1 （HBD-1） level compared between community-acquired pneumonia children and control subjects

表2 不同病原體肺炎之間HBD-1比較Table 2 Serum human β-defensin 1 （HBD-1） level in children with community-acquired pneumonia in terms of pathogen

2.3 重度肺炎和輕度肺炎比較

重度肺炎和輕度肺炎比較：兩組在性別上無顯著差異，在年齡上有顯著差異，前者年齡顯著小于后者，但兩者HBD-1水平差異無統計學意義（P ＞?0.05），見表3。

表 3 重度肺炎和輕度肺炎HBD-1水平比較Table 3 Serum human β-defensin 1 （HBD-1） level in children with community-acquired pneumonia in terms of disease severity

2.4CAP 不同年齡組HBD-1水平對比

不同年齡組在性別上無差異，＞6個月～12個月組HBD-1顯著高于其他組（F=9.818，P＜0.05）

表4 不同年齡組HBD-1水平比較Table 4 Serum human β-defensin 1 （HBD-1） level in children with community-acquired pneumonia by age group

2.5 相關性分析

HBD-1水平與CRP和中性粒細胞計數：HBD-1水平與CRP 相關性r =0.103，P=0.294，兩者相關性極低且無效；HBD-1水平與中性粒細胞計數相關性r =0.032，P=0.742，兩者相關性極低且無效。

3 討論

HBD是一類廣泛存在于動植物體內的小分子陽離子內源性抗微生物肽，富含半胱氨酸、精氨酸，是生物長期與疾病對抗中進化而來的，參與機體最初防御活動，是極為重要的一類內源性抗菌肽[5]。據半胱氨酸殘基的位置和二硫鍵連接方式，HBD分為α、β、θ 3種，HBD-1存在于哺乳動物的組織細胞中[6]，目前發現6種人HBD，其中HBD-1于1995年由德國學者最先從經受透析治療的腎衰竭患者的血漿中發現[1]，在以后的研究中發現其基因可在上皮細胞內廣泛表達[7]，包括氣管、細支氣管、肺泡上皮細胞及黏膜下腺體、腎臟、泌尿生殖道、扁桃體及牙齦細胞等。已有研究表明，HBD-1在呼吸道黏膜上皮抵抗微生物入侵、在肺的免疫炎性反應中起著重要作用[5]，且近年來研究發現人HBD-1對益生菌無作用，故不會打破人體腸道菌群的平衡[8]，對HBD的研究有待深入。

本研究中，以CAP患兒為研究對象，發現CAP組與對照組的HBD-1水平有顯著差異，CAP中無論細菌、病毒、肺炎支原體或肺炎衣原體組的HBD-1水平遠高于對照組，有顯著的統計學差異。而病毒組、細菌組及肺炎支原體或肺炎衣原體組的HBD-1水平的兩兩對照研究，差異無統計學意義。既往研究認為HBD-1基因表達不受脂多糖等炎性因子的刺激，無轉錄調解因子NFKB的結合位點，故一直以來被認為是固有表達[9]。而新近的研究發現卡介苗能增強體外人肺腺癌細胞（SPC-A-1） HBD-1 mRNA的表達及其抗菌活性，增強表達具有刺激物劑量和時間依賴性[10]。在本研究中HBD-1表達水平在CAP各組之間均無顯著性差異，且HBD-1水平與CRP和中性粒細胞計數相關性極低，這表明細菌、病毒、支原體、衣原體等病原體的感染，均能誘導機體HBD-1的表達，對感染的病原體均有廣譜的抗微生物活性，在一定程度上參與感染性疾病的全身炎性反應。另據張濤等[11]研究發現，反復肺炎的患兒血清HBD-1顯著低于健康對照組；反復肺炎嬰幼兒存在血清HBD-1、IgA、IgG水平低下的現象，提示呼吸道免疫防御功能存在障礙，這可能是嬰幼兒反復肺炎的免疫因素之一。本研究表明重度肺炎與輕度肺炎外周血HBD-1水平差異無統計學意義，說明其在感染型疾病的表達和應激方面無差異。研究發現新生兒氣道黏膜可分泌包括HBD-1在內的內源性抗菌肽，其水平與成人的相當。當存在感染及炎性反應時，HBD-1表達即上調[12]。本研究發現，＞6個月～12個月組HBD-1顯著高于其他年齡組，考慮HBD-1為非特異免疫，出生后相對固定，而5～6個月后來自母體的IgG抗體減少甚至消失，感染機會增多，誘導機體HBD-1的表達增加，而作為非特異免疫，隨著年齡增長，不斷與致病及非特異病原體作對抗，從而導致對HBD-1的消耗。

綜上，CAP患兒的HBD-1呈高水平表達，說明HBD-1除了作為機體固有免疫的一部分參與到抗感染過程，而且在獲得性免疫方面亦可發揮重要的作用；而在CAP的病毒組、細菌組及肺炎支原體或肺炎衣原體組的組間差異無統計學意義，反映出HBD-1對各類病原體呈現出非特異性的、廣譜的抗感染免疫功能。

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