大麗輪枝菌V991b及其變異體的培養性狀及致病力研究

黃薇+袁斌+金利容+劉友梅+萬鵬

摘要：以大麗輪枝菌（Verticillium dahilae）V991b和V991w為研究對象，研究其在PDA培養基上的培養性狀、溫度對其生長發育的影響及其對棉苗的致病力。結果表明，兩種病原菌的生長曲線基本呈線性關系。25 ℃下，V991b和V991w菌株在PDA培養基上培養16 d后菌落直徑之間差異不顯著，且在培養過程中二者之間的生長速率差異不顯著。培養溫度會影響病原菌表型的變化，30 ℃下V991b中微菌核數量明顯減少，培養性狀逐步接近于V991w，而V991w形態上不發生變化，PDA培養基中培養16 d V991b和V991w菌落生長直徑有顯著性差異。35 ℃下，V991b不生長，V991w菌落呈膜狀，生長形態類似酵母菌。V991w對高溫的耐受顯著強于V991b。溫度對V991b微菌核的產生有明顯影響，35 ℃以上的高溫與5 ℃以下的低溫都不利于微菌核的產生。查氏液體培養基搖菌后接種棉苗，接種25 d后，兩種病原菌的致病力差異顯著，分別為48.869和21.777。

關鍵詞：大麗輪枝菌（Verticillium dahilae）；培養性狀；致病力；變異體

中圖分類號：S432.4+4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）24-4777-05

大麗輪枝菌（Verticillium dahilae Kleb.）是一種土傳性的病原菌，在世界范圍內對多種大田作物、蔬菜、水果、紫荊和榆樹等園林植物都造成不同程度的危害，并且還在逐年擴大[1]。大麗輪枝菌的變異程度高，微菌核的抗逆性強，存活時間長，一旦定殖下來就很難清除。由于大麗輪枝菌的變異性強，在與寄主協同進化的過程中常發生生理分化，產生新的致病類型或生理小種，這種變異性為棉花抗病品種的選育和對黃萎病的防治都造成了極大的困難?？共∑贩N的缺乏、肥料的濫用導致土壤中微生物生態失衡、氣候環境的變化等多方面的影響，使它上升成了棉花上的一種主要病害，輕則導致棉花減產，嚴重情況下會導致大面積的棉田絕收[2，3]。對大麗輪枝菌的研究多集中在對于同一地區或者不同地區的致病型分化和致病力鑒定上，不同地區病原菌之間的致病力差異非常顯著，同一棉田中病原菌的致病力也有較大差別[4]，甚至同一病株上分離得到的病原菌致病力之間也存在較大差異[5]。因為病原菌在遺傳背景上有較大差異，各地分離得到的單株之間并無可比性。湖北省農業科學院植保土肥研究所棉病實驗室在繼代過程中從大麗輪枝菌菌株V991中得到一株突變菌株V991w，對突變株經過多次繼代培養后，發現其表現為菌絲型，氣生菌絲茂盛，且其性狀可穩定遺傳。經查氏培養基培養產孢后接種，其致病力明顯弱于V991，經過rDNA-ITS分子鑒定表明突變株和對照菌株的DNA序列完全相同，但在PDA培養基中二者的生物學特性及致病力完全不同。本研究希望在同一遺傳背景條件下，從菌株的基本生物學特性入手，以野生型V991b及其突變株V991w為研究對象，調查其生物學性狀和致病力，以期找到影響病原菌表型和可能與致病力相關的因子，為深入研究病原菌的致病機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 野生型V991b為菌核型菌株，由華中農業大學作物遺傳改良育種國家重點實驗室惠贈；V991w為湖北省農業科學院植保土肥研究所棉病實驗室在PDA培養條件下從V991b菌落中分離得到的突變體，為菌絲型菌株，每2周繼代一次，用5 mm打孔器于菌落外緣生長旺盛的區域打取菌餅，其性狀經過多次繼代后可穩定遺傳。將V991w保種到PDA斜面后置于4 ℃保種，再接種到25 ℃ PDA培養基中，仍表現為菌絲型菌株。

1.1.2 鑒別寄主及種植情況 鑒別寄主有冀棉11、豫棉2067、魯棉28，均為常規棉。冀棉11為感病品種，豫棉2067為耐病品種，魯棉28屬于抗病品種。采用無土基質育苗，使室溫保持在22～28 ℃，棉花種子經硫酸脫絨和雙氧水表面消毒后，置于平皿中以無菌水浸泡2～4 h。種子泡好后，分行播種，播種到浸潤均勻的基質中，保持濕度，保證溫室自然通風，勤加管理。待棉苗長到2～3片真葉時采用裸苗傷根法接種病原菌。

1.2 方法

1.2.1 培養基 供試培養基為PDA培養基，其制作參照文獻[6]，去皮馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂 15 g，去離子水1 000 mL。將去皮的馬鈴薯切碎，加水煮沸30 min，用紗布濾去馬鈴薯，加水補足1 000 mL，加糖和瓊脂，加熱使瓊脂完全熔化，趁熱用紗布過濾，分裝至錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 PDA培養基培養病原菌的形態結構及菌落形態的觀察 將V991b和V991w用打孔器取菌落外緣生長旺盛的區域打取5 mm菌餅，分別接種于PDA平皿，25 ℃下黑暗靜置培養15 d后，用電子顯微鏡分別觀察其形態結構和菌落特征。

1.2.3 PDA培養基上溫度對大麗輪枝菌微菌核產生的影響 在直徑為90 mm的培養皿中每皿倒入20 mL PDA培養基，接入20 μL濃度為106 CFU/mL的孢子懸浮液，倒置靜置。同一菌株重復3皿，分別置于5、25、30、35 ℃的培養箱中暗培養，每天顯微鏡下觀察，記錄不同處理大麗輪枝菌微菌核產生的情況。

1.2.4 PDA培養基對大麗輪枝菌生長速率的影響 選取純化培養后的大麗輪枝菌，接種到PDA培養基，同一菌株重復3皿，于25 ℃下倒置暗培養，每隔1 d以十字交叉法測定其菌落直徑，持續調查兩周。

1.2.5 病原菌致病力調查 將V991b和V991w接種到Czapek（查氏）培養液中，于25 ℃條件下，180 r/min搖菌7 d，獲得菌懸液，經過雙層濾紙真空抽濾，配制成濃度為10^7CFU/mL的孢子懸液。采用浸根法接種棉苗。接種前將棉苗慢慢托起，不致大量傷根和傷苗。每個品種至少取60棵苗，將3個鑒別品種分開標記，保持根部基本整齊一致，然后置于同一菌系的菌懸液中，使根能夠充分接觸到菌液。裸苗浸根接種30 min，移栽到營養缽中。每個營養缽中4～5株棉苗，置于溫室中，室溫保持22～28 ℃，自然通風，精心管理[4]。endprint

1.3 數據分析

采用DPS單因素方差和Duncans新復極差測驗的多重比較分析試驗數據。

2 結果與分析

2.1 PDA培養基上病原菌的形態結構及菌落形態

由圖1可知，從菌落形態上看，在PDA培養基上，V991b為菌核型菌落，正面有明顯可見的白色氣生菌絲遍布于菌落表面，菌落邊緣菌絲呈枝狀，背面菌落呈黑色，菌落輪紋不明顯。大約經過6～7 d出現肉眼可見的黑色素；V991b的產孢量高于V991w，氣生孢子產生多且量大，典型的輪枝狀結構非常清晰，4、5個孢子叢生，且微菌核分散。從電子顯微鏡上來看，微菌核為多個厚壁的黑色細胞集結形成，糾結成一團，在外緣有部分呈半透明狀的細胞。

由圖2可知，V991w在PDA培養基上表現為菌絲型菌落，正面有濃密的氣生菌絲，平鋪在菌落表面，背面呈白色，無輪紋。在PDA培養基上形成的菌落質地致密，結構緊湊；V991w的氣生孢子較少，稀疏分布，鏡檢結果發現菌絲占大多數，氣生孢子相對來說較少，同樣存在輪枝狀結構，但數量少，沒有微菌核。

2.2 溫度對大麗輪枝菌微菌核產生的影響

將野生型V991b和突變株V991w接種到PDA培養基上，分別倒置于5～35 ℃的恒溫箱中暗培養15 d，其培養性狀及菌落直徑結果見圖3、圖4、表1。結果表明，5 ℃條件下，V991w生長速度極慢，V991b幾乎不生長。說明低溫明顯抑制V991b和V991w的生長。25 ℃條件下，15 d后兩種病原菌菌落生長直徑無明顯差異，且在生長過程中V991b和V991w差異也不明顯（圖1）。30 ℃條件下，V991b只在平皿中央出現少量黑色素，隨著培養時間的延長黑色素所占比例減少，氣生菌絲多且濃密，培養性狀逐步接近V991w；而V991w形態上不發生變化，但生長速度稍慢于V991b；V991w平均生長速率為2.3 mm/d，而V991b的平均生長速率為2.6 mm/d。培養15 d，V991b直徑達到4.0 cm，V991w直徑達到3.5 cm。35 ℃條件下，V991b不生長，V991w氣生菌絲消失，菌落呈膜狀緊貼于培養基表面，表面為淡黃色，類似酵母菌的形態（圖3）。

由表1可知，15 ℃條件下，微菌核產生數量最多，且極顯著多于其他溫度，但25 ℃條件下產生微菌核的直徑最大，高溫會導致微菌核數量的下降（圖4）。溫度對野生型V991b微菌核的產生有明顯影響，35 ℃以上的高溫與5 ℃以下的低溫都不利于微菌核的產生，微菌核產生的最適溫度為15～25 ℃，此溫度區間微菌核的數量較其他溫度有明顯提升。

高于30 ℃條件下，V991b培養性狀逐步接近于V991w；而V991w形態上不發生變化，35 ℃條件下，菌核型菌株停止生長，菌絲型菌株表型發生變化，長期的高溫脅迫會導致病原菌的表型發生變異。溫度試驗結果表明，菌絲型菌株V991w對高溫的耐受能力強于菌核型菌株V991b。

2.3 病原菌生長速率的測定

從供試菌株的菌落邊緣取直徑約2～3 mm的菌絲塊，分別接種到PDA培養基的平皿中央，于25 ℃恒溫培養箱內黑暗培養，3次重復，15 d后測量菌落直徑。調查結果見圖5。25 ℃條件下，培養16 d，在PDA培養基上，V991b和V991w的菌落生長直徑分別為5.833和6.167 cm；DPS的單因素方差和Duncans新復極差測驗的多重比較分析結果表明，PDA培養基中強弱菌株菌落的生長速率差異不明顯，菌株直徑間的差異不顯著。

由圖6可知，30 ℃條件下，培養16 d，V991w平均生長速率為2.27 mm/d，而V991b的平均生長速率為2.60 mm/d，V991b和V991w的菌落生長直徑分別為4.037和3.562 cm。DPS的單因素方差和Duncans新復極差測驗的多重比較分析結果表明，接菌后16 d，PDA培養基中強弱菌株菌落的生長速率間差異明顯，而菌株直徑間差異顯著。

2.4 病原菌致病力的測定

經查氏培養基搖菌后調查結果如表2所示，接種5～7 d棉苗開始顯現病癥，接種后7 d，V991b和V991w的平均病情指數分別為5.151和7.121。隨著接種時間的推移，棉苗的病情指數逐漸上升。接種后15 d，V991b和V991w的病情指數出現明顯的差異，V991b的病情指數為25.109，V991w的病情指數為13.771，V991b的病情指數幾乎達到V991w的兩倍。接種后25 d，V991b的平均病情指數為48.869，V991w的平均病情指數為21.777。15 d后的病情調查表明，菌核型菌株（V991b-CA）的致病力明顯強于菌絲型菌株（V991w-CA）的致病力。

3 小結與討論

3.1 溫度和培養條件會影響病原菌的表型

白應文等[7]發現受試菌株在不同溫度下產生微菌核的數量及直徑間存在顯著差異，20 ℃時產生的微菌核數量最多且個體最大。將多個菌株置于（20±1） ℃，菌株的病情指數與其產生微菌核的數量及直徑間均無相關性。在本試驗中微菌核在10～30 ℃條件下均能出現，過高溫度（30 ℃）或過低溫度（10 ℃）會明顯減少微菌核的數量，長時間處于30 ℃以上的培養條件下，微菌核會減少甚至消失。微菌核產生的最大直徑與其他研究人員不同，可能是與菌株的個體差異性有關，相同地區的黃萎病菌菌株之間微菌核的大小也存在較大差異，如XJ592和XJ511菌株的微菌核大小分別為62.09和51.37 μm[7]。大麗輪枝菌的微菌核作為一種抗逆性結構，用來抵御不良環境對病原菌產生的影響[8]，豐富的營養條件可能不利于微菌核的產生，導致大麗輪枝菌發生退化或突變。大麗輪枝菌在進行室內培養時非常容易發生角變，也可能與真菌的培養條件有關系[9，10]。在試驗過程中發現，經PDA培養基上多次繼代后，V991b菌株會出現退化現象，菌落表面氣生菌絲少，微菌核數量明顯減少，會變成僅有少量微菌核的中間型菌落，但隨著培養時間的延長仍會轉化為菌核型菌株。endprint

白應文等[7]通過比較培養基發現，將BM培養基中葡萄糖用量減半，并在培養基表面覆蓋玻璃紙，可使大麗輪枝菌的微菌核產量提高3.7倍，表明在營養優越的條件下，作為抗逆性結構的微菌核產量可能會下降，與本試驗的觀察是一致的。

3.2 產生致病力變化的可能原因

對于以機械力侵染寄主組織的病原菌來說，如稻瘟菌、炭疽病菌等，附著孢中產生沉積的黑色素是病菌具有致病性和侵入寄主的前提，黑色素化的附著孢外壁能使病原菌積累足夠的膨壓穿透寄主表皮[11]。黑色素還可以有效清除活性氧自由基，保護生物體DNA免受輻射傷害。黑色素對菌絲的生長和繁殖不起作用，但可以加強真菌在不良環境條件下的生存和競爭能力，保護微生物免受紫外線和溶菌酶等的作用[12]。Lee等[13]研究發現黑色素可以加固細胞壁，提高分生孢子和菌絲對寄主免疫系統的抵抗力，增強病原菌的侵染能力。但在大麗輪枝菌中，黑色素與致病力之間無相關性，白色菌絲型菌株也有致病力強的菌株[14]。

在室內25 ℃培養條件下，突變株V991w和野生型V991b的生長速率并沒有明顯差異，經查氏液培養接種棉苗后，致病力有顯著變化，培養25 d時V991b平均病情指數為48.869，V991w平均病情指數為21.777。有研究認為微菌核的黑色細胞是病原菌度過逆性脅迫的關鍵結構，而半透明細胞可在適宜條件下進行菌絲萌發[15]。培養基條件會影響大麗輪枝菌的表型和微菌核數量，但對野生型V991b和突變株V991w的顯微結構有無影響尚未知曉。當菌株長期處于營養豐富條件時，微菌核中的黑色細胞數量逐漸減少，產生退化，與菌絲萌發生長相關的半透明細胞糾結成團，形成主要結構，從而導致突變株的表型和致病力發生改變；或者是受豐富培養基誘導，致使病原菌基因組序列上的某些基因表達量發生變化，導致菌株的表型和致病力發生變化。菌株致病力的變化是由病原菌在寄主植物內的數量差異導致的，還是由于病原菌對植物的侵染力改變導致的，還需試驗進一步驗證。

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