GB/T 18204.4-2013《公共場所衛(wèi)生檢驗方法 第4部分：公共用品用具微生物》存在問題的探討

段朝標(biāo)　肖利軍　李慧

縣級以上疾病預(yù)防控制機構(gòu)應(yīng)當(dāng)承擔(dān)衛(wèi)生計生行政部門下達的公共場所健康危害因素監(jiān)測任務(wù)[1]。公共場所衛(wèi)生監(jiān)測是省市縣三級疾控機構(gòu)在健康危害因素監(jiān)測與干預(yù)基本職責(zé)中的主要工作任務(wù)。隨著人們生活水平不斷提高，消費觀念的轉(zhuǎn)變，公共場所衛(wèi)生質(zhì)量越來越受到重視。公共場所衛(wèi)生監(jiān)測已成為各級疾控機構(gòu)重要的日常工作。

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局和國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會于2013年12月31日發(fā)布GB/T 18204.4-2013《公共場所衛(wèi)生檢驗方法 第4部分：公共用品用具微生物》[2]（以下稱2013年版標(biāo)準(zhǔn)），并于2014年12月1日正式實施。2013年版標(biāo)準(zhǔn)代替了GB/T 18204.2～18204.8-2000、GB/T 18204.11～18204.12-2000等9個公共場所公共用品用具微生物衛(wèi)生檢驗方法的全部內(nèi)容，部分代替GB/T 17220-1998《公共場所衛(wèi)生監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》中的公共用品用具采樣要求[3]，集中用一個標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了公共場所用品用具的檢驗方法；將原2000年版的單個檢驗方法中的采樣方法歸集至新標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)范性附錄A中，并對用品用具種類進行了新的分類和命名。但在實際使用中發(fā)現(xiàn)2013年版標(biāo)準(zhǔn)中仍然存在較多問題。本文通過對照與GB/T 18204.4-2013同期有關(guān)細菌總數(shù)、大腸菌群、金黃色葡萄球菌、真菌總數(shù)和溶血性鏈球菌5種微生物檢驗相類似的國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法，并結(jié)合筆者在實際檢驗過程中的經(jīng)驗，對該標(biāo)準(zhǔn)中在術(shù)語描述、技術(shù)細節(jié)及編排等方面存在的不足之處，提出了更改建議，以期為今后此標(biāo)準(zhǔn)的再次修訂提供有益參考，促進公共場所衛(wèi)生檢驗方法不斷完善。

本文依照2013年版標(biāo)準(zhǔn)編排格式的順序進行論述，對相應(yīng)條款存在的問題予以指出和探討。

1　標(biāo)準(zhǔn)的范圍部分

2013年版標(biāo)準(zhǔn)第一段描述“本部分規(guī)定了公共場所用品用具細菌總數(shù)……的采樣和測定方法”。這里使用的術(shù)語“測定”不夠準(zhǔn)確。測定是指獲得某一特定對象的數(shù)據(jù)信息的方法和過程。而本部分方法中大腸菌群、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌均為定性實驗，所以統(tǒng)一使用“檢驗”更確切。包括第二段的“……的測定”也應(yīng)改為“檢驗”。另外本節(jié)第二段金黃色葡萄球菌錯印為“金黃葡萄球菌”。

2　細菌總數(shù)平皿計數(shù)法部分

2.1　培養(yǎng)基和試劑

生理鹽水（原標(biāo)準(zhǔn)3.1.1）的描述存在三個不妥之處：（1）稱謂：“生理鹽水”應(yīng)該稱為“無菌生理鹽水”；（2）“生理鹽水成分”的“成分”應(yīng)另起一行，與“制法”條款對應(yīng)，即為“3.1.1生理鹽水，3.1.1.1 成分，3.1.1.2 制法”的編排結(jié)構(gòu)；（3）無菌生理鹽水不宜以10 mL每管分裝后滅菌。為防止高壓滅菌時導(dǎo)致試管中液體流失而引起體積不準(zhǔn)確，一般應(yīng)將滅菌后的生理鹽水按試驗實際需要（9 mL或10 mL或20 mL等）無菌操作分裝到滅菌試管中備用。

營養(yǎng)瓊脂成分（原標(biāo)準(zhǔn)3.1.2）編排中出現(xiàn)了3.1.1同樣的不妥之處。另外本條還出現(xiàn)錯誤：作為細菌總數(shù)培養(yǎng)中的唯一培養(yǎng)基“營養(yǎng)瓊脂”在3.3.4 樣品的培養(yǎng)中卻以“平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基”出現(xiàn)，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基與平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基的成分不同，并非同一培養(yǎng)基。目前實驗室已經(jīng)普遍使用商品化的“平板計數(shù)瓊脂”替代“營養(yǎng)瓊脂”用于菌落總數(shù)計數(shù)試驗。平板計數(shù)瓊脂代替營養(yǎng)瓊脂，培養(yǎng)基成分的改變更利于細菌的恢復(fù)和生長[4]。

2.2　儀器和設(shè)備

“3.2.8 無菌試管、平皿（直徑9 cm）、刻度吸管等”有3處需改進的地方：（1）所用器具應(yīng)標(biāo)明規(guī)格和精度，無菌試管在本處的規(guī)格應(yīng)該為15 mm×140 mm，刻度吸管的規(guī)格為1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）；（2）為使描述更為嚴(yán)謹(jǐn)：平皿及刻度吸管均應(yīng)無菌，應(yīng)該描述為“無菌平皿、無菌吸管”；（3）在刻度吸管后應(yīng)加上“或微量移液器及吸頭”，本處未對移液器及吸頭進行描述，但在3.3 檢驗步驟中卻多次提及。

2.3　不同稀釋度菌落計數(shù)計算規(guī)則（原標(biāo)準(zhǔn)3.5）

在3.5.1中，“……乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，作為每毫升中菌落總數(shù)結(jié)果”存在語法錯誤，每毫升是一個數(shù)量，缺少主語，應(yīng)當(dāng)描述為“每毫升試樣中菌落總數(shù)結(jié)果”；即使這樣也還存在問題：公共用品用具檢測采集的樣品是器具表面的“一定面積”，即用無菌棉拭子涂抹一定面積，將采樣棉拭子浸入10 mL無菌生理鹽水制成“檢驗初始液”，也即以10 mL生理鹽水代替“一定面積”進行實驗室檢驗，因此菌落總數(shù)計算結(jié)果可以認(rèn)為是10 mL檢驗初始液所含菌落總數(shù)，這樣便于在3.6結(jié)果報告中計算公共用品用具的菌落總數(shù)。在3.5.2、3.5.5中存在類似問題：3.5.2中N.一定面積的菌落總數(shù)，也即10 mL檢驗初始液所含菌落總數(shù)，其單位應(yīng)為CFU，而非CFU/mL；3.5.5中“若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算”，本標(biāo)準(zhǔn)中采集的樣品并不存在液體原液樣品。

另外，本節(jié)中的10 mL檢驗初始液所含的菌落總數(shù)應(yīng)當(dāng)指明以“N”指代，而不是只表示3.5.2中所計算的結(jié)果。這也是對3.6結(jié)果報告的銜接。在3.5.2中“N”值的計算公式采用美國食品藥品管理局（FDA）《細菌學(xué)分析手冊》第3章菌落總數(shù)（2001年 ）（Bacteriological Analytical Manual，Chapter 3;Aerobic plate count，2001）[5]，首次使用于 GB/T 4789.2-2008《食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》，并經(jīng)GB 4789.2-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》修改了菌落總數(shù)計算公式中的解釋[6]，此后，在制定其他種類樣品的菌落總數(shù)檢驗標(biāo)準(zhǔn)時，這個菌落總數(shù)計算方法一直被引用。但2013年版標(biāo)準(zhǔn)在引用時只是照搬引用，而未根據(jù)公共場所樣品采集的特殊性進行必要的修改。

2.4　結(jié)果報告（原標(biāo)準(zhǔn)3.6）

本節(jié)中存在計算公式錯誤和缺少關(guān)鍵性描述。

計算公式：A= N×b/k及其對相應(yīng)字母的注釋中存在以下錯誤：（1）A-細菌總數(shù)測定結(jié)果。沒有給出單位，不能體現(xiàn)相應(yīng)樣品的結(jié)果；（2）N-平板平均菌落數(shù)，單位為CFU；平板平均菌落數(shù)，太過籠統(tǒng)，與3.5相關(guān)內(nèi)容脫節(jié)；（3）b-稀釋倍數(shù)，此處出現(xiàn)稀釋倍數(shù)，與3.5相關(guān)內(nèi)容脫節(jié)；（4）k-根據(jù)采樣面積、標(biāo)準(zhǔn)限值單位得出的系數(shù)。k值不是一種系數(shù)，而是指代一定的采樣面積，即依照本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范性附錄A采集不同類型樣品時的面積，即使是系數(shù)，也應(yīng)當(dāng)在此處表述清楚每種樣品所代表的系數(shù)的數(shù)值和意義。

根據(jù)3.5計算規(guī)則得出10 mL檢驗初始液的菌落總數(shù)值（N），公共用品用具菌落總數(shù)可以使用公式計算：A=N/S，其中A-公共用品用具細菌總數(shù)結(jié)果，單位為CFU/S cm2；N為3.5所得10 mL檢驗初始液的菌落總數(shù)；S為10 mL檢驗初始液指代的公共用品用具采樣面積的數(shù)值，具體數(shù)值見本標(biāo)準(zhǔn)附錄A《公共場所公共用品用具微生物采樣方法》。這個計算公式保持了與本標(biāo)準(zhǔn)總體相關(guān)內(nèi)容的銜接，計算過程明確，指向清楚，不會產(chǎn)生歧義。

本節(jié)缺少菌落總數(shù)報告時的關(guān)鍵性描述：數(shù)值修約、結(jié)果判定、空白對照說明等。因此將結(jié)果計算列為3.6.1，則還需補充3.6.2 菌落數(shù)小于100 CFU時，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報告；3.6.3菌落數(shù)大于或等于100 CFU時，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后；取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字；3.6.4 若所有平板上為蔓延菌落而無法計數(shù)，則報告菌落蔓延。3.6.5 若空白對照上有菌落生長，則此次檢驗結(jié)果無效。

3　大腸菌群多管發(fā)酵法部分

3.1　檢驗步驟

原標(biāo)準(zhǔn)4.3.2中“檢樣倒入雙料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液中”未指明檢樣的來由和使用體積。檢樣應(yīng)當(dāng)指明為“將放有采樣后棉拭子的試管充分震搖，此液為1∶10的檢驗初始液（檢液）”；應(yīng)當(dāng)指明將多少毫升檢樣“接種”到雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管中；使用“倒入”一詞顯得不專業(yè)，“雙料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液中”應(yīng)當(dāng)描述為“10 mL帶小倒管的雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管中”。本條第三句，未將產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的觀察現(xiàn)象具體描述，應(yīng)描述為“觀察產(chǎn)酸（培養(yǎng)液變黃），產(chǎn)氣（小倒管中有氣體）現(xiàn)象”。

證實性試驗（原標(biāo)準(zhǔn)4.3.4）：應(yīng)該將“挑取可疑大腸菌群菌落1個～2個進行染色鏡檢”描述為“挑取可疑大腸菌群菌落不少于3個（不足3個全挑）進行染色鏡檢”。另外，本條描述不完整，證實性試驗培養(yǎng)后缺少觀察的現(xiàn)象和結(jié)果。應(yīng)將4.4中“凡乳糖發(fā)酵管最終產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌”在4.3.4中作為觀察現(xiàn)象描述，并表明結(jié)果“則為大腸桿菌陽性”。

3.2　結(jié)果報告

標(biāo)準(zhǔn)原文只描述了“檢出大腸菌群”的結(jié)果，無“未檢出大腸菌群”結(jié)果。結(jié)合4.3 檢驗步驟中相關(guān)調(diào)整，結(jié)果報告應(yīng)描述為“綜合以上實驗結(jié)果，報告檢出或未檢出大腸菌群”。

在“4 大腸菌群多管發(fā)酵法”的操作中未使用多管（2管以上）雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管進行試驗，與方法命名不符。根據(jù)GB 9663-1996公共用具清洗消毒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定大腸菌群使用的單位為“個/50 cm2”[6]，而使用多管發(fā)酵法的報告結(jié)果為大腸菌群最可能數(shù)（MPN），如要報告為“個/50 cm2”，宜采用大腸菌群平皿計數(shù)法檢驗更為合理。

4　真菌總數(shù)平皿計數(shù)法部分

4.1　檢驗步驟

該部分內(nèi)容只有樣品稀釋過程，缺少“樣品的接種”關(guān)鍵性步驟詳細描述，6.3.2中第二段話不能表明樣品接種的內(nèi)容；缺少空白對照接種的描述。

4.2　菌落計數(shù)

此部分存在的錯誤與細菌總數(shù)平皿計數(shù)法中3.4、3.5、3.6相同，在此不再贅述。

5　溶血性鏈球菌培養(yǎng)法部分

5.1　培養(yǎng)基和試劑

葡萄糖肉浸液肉湯成分（原標(biāo)準(zhǔn)7.1.1）中缺少關(guān)鍵的葡萄糖成分，按1%的含量算，主成分葡萄糖應(yīng)該是10 g。主要試劑中還缺少溶血性鏈球菌的生化鑒定試劑。7.1.6 滅菌生理鹽水未指明其成分和制法的來源：見細菌總數(shù)平皿計數(shù)法中培養(yǎng)基和試劑3.1.1。

5.2　操作步驟

操作步驟（原標(biāo)準(zhǔn)7.3.2）中缺少關(guān)鍵的細菌鑒定試驗：觸酶試驗和鏈激酶試驗。特別是在7.1培養(yǎng)基和試劑中列出了鏈激酶試驗所用試劑草酸鉀人血漿和0.25%氯化鈣，卻并沒有針對性的進行鑒定試驗描述。

6　規(guī)范性附錄A

在A.3采集部位與采集面積中，A.3.1杯具采樣總面積為50 cm2，而GB 9663-1996《旅店業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中茶具細菌總數(shù)的單位為cfu/mL[7]，沒有任何依據(jù)證明將采樣面積與茶具盛裝液體進行相互換算的科學(xué)性和必要性。

原標(biāo)準(zhǔn)A.3.2、A.3.3、A.3.7中規(guī)定，“每25 cm2采樣面積為1份樣品，每件樣品共采集2份樣品”，但未指明兩份樣品的用途，按每份樣品都要出具檢驗結(jié)果，則同一件樣品可能會出現(xiàn)兩個不同結(jié)果，沒有明確說明如何處理這兩個結(jié)果，致使該標(biāo)準(zhǔn)的使用者無法進行結(jié)果判定。

7　討論

本標(biāo)準(zhǔn)修訂時合并了2000年版9個公共場所用品用具微生物衛(wèi)生檢驗方法，從目前修訂的效果來看，整個修訂并未對整合以前版本的整體相關(guān)性進行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼撟C，缺乏與以前版本的延續(xù)性，并未對以前版本存在的部分缺陷進行修正。希望后續(xù)版本能夠改進，保證標(biāo)準(zhǔn)修訂后更具嚴(yán)謹(jǐn)性、延續(xù)性、整體性。

1996年發(fā)布實施的公共場所衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB 9663- GB 9673，GB 16153）整體已經(jīng)明顯落后于社會發(fā)展，無法適應(yīng)經(jīng)過二十多年來公共場所事業(yè)快速發(fā)展的現(xiàn)實衛(wèi)生狀況，公共場所衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)一直沒有修訂也遲滯了公共場所衛(wèi)生檢驗標(biāo)準(zhǔn)方法進行實質(zhì)修訂[8]。2013、2014年版的公共場所衛(wèi)生檢驗方法進行了大幅度的修改，取得了較好的效果，但公共場所衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)不進行更新，就無法從根本上突破公共衛(wèi)生檢測檢驗工作的發(fā)展瓶頸，因此相關(guān)部門應(yīng)加大力度推出新的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。

[1]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會． 公共場所衛(wèi)生管理條例實施細則（衛(wèi)生部令第80號）[EB/OL]． [2017-10-16]．http：//www．nhfpc．gov．cn/zwgk/wlwl/201103/92f44402042549258 9f273a486468903．shtml．

[2]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員． 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)批準(zhǔn)發(fā)布公告2013年第27號[S/OL]． [2017-10-16]． http：//www．csres．com/notice/42412．html．

[3]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會． GB/T 18204．4-2013公共場所衛(wèi)生檢驗方法 第4部分：公共用品用具微生物[S]． 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014：Ⅲ．

[4]楊慶文，國譯丹，周惠新，等． 不同濃度TTC平板計數(shù)瓊脂細菌生長試驗觀察[J]． 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2012，22（1）：62-63．

[5]中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會． GB/T 4789．2-2008食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定[S]． 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009：3-4．

[6]中華人民共和國國家衛(wèi)生部． GB 4789．2-2010國家食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定[S]． 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010：1-4．

[7]國家技術(shù)監(jiān)督局． GB 9663-1996 旅店業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S]． 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006：2．

[8]郝欣欣，阮水富． 公共場所衛(wèi)生監(jiān)督現(xiàn)狀及法律修訂對策研究[J]．中國衛(wèi)生法制，2017，25（6）：45-47．