淺談微生物限度檢查方法適用性試驗資料的規范性

張紅霞 李加恒

微生物限度檢查法是評價生產企業的藥用原料、輔料、設備、器具、工藝流程、環境和操作者衛生狀況的重要手段和依據，其檢驗項目包括染菌量及控制菌的檢查[1]。2015年版《中國藥典》規定供試品染菌量的檢查“按計數方法適用性試驗確認的計數方法進行供試品中需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的測定[2]”、供試品控制菌檢查中的增菌培養過程需要“經方法適用性試驗確定[3]”，凡是進行藥品的微生物限度檢查，都需要一套要求更高的真實、完整、規范的該藥品的微生物限度檢查方法適用性試驗資料。筆者在2016—2017年監督及復核檢驗過程中，共收集了112份試驗資料，在羅書香[4]等人進行微生物限度檢查驗證資料分析過后，這112份試驗資料在內容完整性、規范性及嚴謹性等方面仍存在較多問題。為了以后微生物限度檢查的順利進行，本文就所收集到的試驗資料中存在的主要問題進行統計和分析，以期在節約人力物力的基礎上，保證最終檢驗結果的準確性。

1 存在的問題

1.1 內容不完整

無藥品生產廠家信息者4個，占3.6%；無試驗單位信息者和無公章者各6個，占10.8%；無試驗單位聯系方式者83個，占74.1%；試驗資料未編號者36個，占32.1%。

1.2 檢品信息不完整

未提供檢品信息者和批號者各2個，占3.6%；未提供檢品包裝信息者33個，占29.5%；未提供批準文號者12個，占22.3%；未提供檢品規格者8個，占7.1%。

1.3 存在的較多問題

無處方來源或主要成份者109個，占97.3%；無制劑方法者110個，占98.2%；無檢驗依據者74個，占66.1%；無實驗室環境潔凈度記錄者111個，占99.1%；未提供試驗儀器信息者11個，占9.8%；試驗儀器無編碼者106個，占94.6%；無校驗記錄者94個，占83.9%。

1.4 培養基信息存在的問題

無信息者5個，占4.5%；無適用性檢查者19個，占17.0%；培養基信息不全者5個，占4.5%。

1.5 菌種資料不完整

無信息者2個，占1.8%；無菌種來源者20個，占17.9%；未提供菌種代數者6個，占5.4%；無菌落確認試驗者和選擇菌種錯誤者各7個，占12.6%。

1.6 計數方法適用性試驗存在的問題

未提供方法者6個，占5.4%；方法少陰性對照者28個，占25.0%；方法選擇錯誤者1個，占0.9%；無培養時間者10個，占8.9%；培養時間超過規定者和無培養記錄者各4個，占7.2%；未按照計數方法規定“所加菌液的體積應不超過供試液體積的1%”者7個，占6.3%；無回收率結果者1個，占0.9%。

1.7 其他問題

試驗過程中未做供試液對照組有80個，占71.4%，其中未提供中和劑對照組結果者9個，占8.0%；試驗次數不夠者57個，占50.94%：其中控制菌檢查方法適用性試驗僅提供1次試驗結果有40個，占35.7%；試驗結果與結論不一致者5個（如金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌試驗結果列表顯示為“24%、31%、20%”和“15%、16%、14%”，而結論卻為“回收率高于70%”），占4.5%；試驗過程表述不完善者16個（如取供試液，采用0.5 ml試驗等類似表述），占14.3%；試驗用語不準確者102個（例如“適用性試驗”寫成“驗證試驗”、菌落形成單位誤寫成“CFU/g”），占91.1%；試驗中所用培養基具體多少量不清楚者14個（如“取不少于100 ml的膽鹽乳糖增菌培養基”等），占12.5%；無結論或結論不全者14個，占12.5%；藥品微生物限度檢查方法適用性試驗資料中仍存在“胰酪大豆胨瓊脂”錯寫成“胰絡大豆胨瓊脂”的情況，甚至有1份資料存在僅有不完整結論的現象。

2 討論

2.1 資料信息

藥品生產企業的名稱及聯系方式是表明藥品質量和安全的重要內容，同品種藥品不同的生產企業由于各方面的差異，微生物限度檢查適用性試驗方法很可能存在較大不同；驗證單位信息的重要性更是不言而喻，它是各試驗及復驗單位的技術人員對相關標準理解及操作步驟具體實施等內容商討的重要途徑。

2.2 檢品信息

待測樣品信息通常應包括檢品名稱、批準文號、規格、包裝、批號、數量、處方來源或主要成份、制劑方法、檢驗依據、給藥途徑等。歷版《中國藥典》都是按照給藥途徑、制劑方法、藥物成份來制定制劑的微生物限度標準，如2015版《中國藥典》[1]將“非無菌含藥材原粉的中藥制劑”標準中的固體口服給藥制劑細分為是否含有豆豉、神曲等發酵原粉的情況，藥品所含成份不同，標準亦有較大變化；中藥制劑如若沒有制劑方法，也就無法得知其是否含有藥材原粉，相對應的標準也就大相徑庭；藥典明確規定“用于手術、嚴重燒傷、嚴重創傷的局部給藥制劑應符合無菌檢查法規定”，用于表皮或黏膜是否完整的固體局部給藥制劑其在需氧菌總數的標準上相差1個數量級，可見給藥途徑信息的重要性。

2.3 試驗環境及設備

藥典對微生物計數試驗環境進行了明確規定，單向流空氣區域、工作臺面及環境應定期進行檢測[5]。新版藥典將潔凈度分為A、B、C、D四個級別，究其原因，一方面是全面與國際藥典標準相接軌，另一方面是從對終產品的檢驗向過程控制轉變，這方面的資料的缺失勢必會影響整個試驗數據的可信度。

112份資料中無儀器校驗記錄者比例較大，約占83.9%。對于微生物試驗來說，溫度、壓力、稱量、容量等都是影響試驗準確性的關鍵參數，一臺沒有經過校驗的培養箱、冰箱、高壓蒸汽滅菌器勢必會影響試驗結果的準確性。

2.4 培養基及菌種

現在實驗室大多使用的是商品化的成品脫水培養基，其質量依賴于其制備過程，從而影響試驗結果的可靠性。所以所有配制好的培養基均應進行質量控制試驗，常規項目包括pH值及適用性檢查試驗。

藥典[1]明確規定，藥品微生物檢驗用的試驗菌均應來自認可的國內或國外菌種保藏機構的標準菌株，或使用與標準菌株所有相關特性等效的可以溯源的商業派生菌株，并且明確規定工作菌株的傳代次數不得超過5代，試驗資料中沒有菌株代數、來源等相關信息，就無法保證其正常的生物學特性，最終影響試驗數據的可靠性及整個資料的完整性。

2.5 計數方法適用性試驗及控制菌檢查方法適用性試驗

計數方法適用性試驗[6]及控制菌檢查方法適用性試驗是整個試驗過程的主體，至關重要。2015版《中國藥典》較老版藥典較大改動的地方是，規定供試液與菌液必須先混合若干時間后再進行計數，且明確了所加菌液的體積應不超過供試液體積的1%，然而占6.3%的資料采用“在試管中加入10 ml供試液，再加入不大于100 cfu/ml的菌液1 ml”來進行試驗組的計數。

3 建議

綜上所述，一份完整的微生物限度檢查方法適用性試驗資料除以上所列主要內容外，建議還應包括下列內容：適用性試驗方案的組織與實施部門及質量管理部門有關人員的簽字，其過程包括方案起草、方案審核和方案批準等步驟；驗證周期、有關制式文件以及偏差處理等[7]。

藥品微生物限度檢查同理化性質檢查及有效成分的含量測定不同，其待檢對象所處的環境多樣，污染源復雜，污染狀態也會出現差異，面對菌細胞的活體易變性，同一生產廠家生產的同一批藥品污染狀態會出現差異，即使同一種菌在不同的劑型中所測得的結果也各不相同。開展微生物限度檢查方法適用性試驗工作，更是一個極冗長繁瑣、耗時耗力的過程，除要建立一個符合標準要求、操作安全的實驗室外，從事微生物檢驗的工作人員必須經過無菌技術及基礎微生物學專業知識的培訓，同時建議有關部門制定相關管理制度，并定期進行抽查和考核，將考核結果利用網絡等大眾媒體進行公示，嚴格規范其相關準入制度，促進我國藥品微生物限度檢查規范有序的發展[8]。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].四部.北京：中國醫藥科技出版社，2015：145-149.

[2] 楊曉莉，李輝，馬英英，等.中國藥典2015年版非無菌產品微生物限度檢查:微生物計數法解讀[J].藥物分析雜志，2016，36（6）：1101-1107.

[3] 楊曉莉，李輝，馬英英，等.《中國藥典》2015年版非無菌產品微生物限度檢查:控制菌檢查法解讀與對策[J].中國藥師，2016，19（4）：748-752.

[4] 羅書香.藥品微生物限度檢查方法驗證資料分析[J].中國藥事，2007，21（7）：525-526.

[5] 張國林.藥品微生物檢驗實驗室質量控制影響因素分析[J].中國衛生產業，2017，14（19）：26-29.

[6] 田冬梅，史春輝，婁志紅，等.藥品微生物計數方法及方法適用性探討[J].中國藥物評價，2017，34（2）：97-99.

[7] 楊平，曾蔚欣，時正媛，等.醫院藥師微生物限度檢查培訓的實踐與體會[J].中國藥師，2017，20（6）：1114-1116.

[8] 柳瑩，相坤.非無菌藥品的微生物限度檢查概述[J].世界最新醫學信息文摘，2018，18（2）：34-35.