microRNA-200c在胰腺癌干細胞中的表達及作用研究

區泳芳 謝健龍

胰腺癌細胞微小核糖核酸microRNA-200c是在胰腺癌疾病患者的生理及病理的過程當中發揮著調控作用的一種物質[1-2]。當前醫學研究上，對多種的腫瘤組織當中都能發現microRNA表達譜出現異常的改變情況，許多研究者認為microRNA與腫瘤發生、發展以及腫瘤的預后存在密切關聯。此外，對于胰腺癌的研究中發現，胰腺癌因過強的侵襲性常常影響到預后[3-5]。在腫瘤的干細胞理論當中認為，腫瘤干細胞與腫瘤侵襲、轉移存在密切的關系，甚至其可能是導致惡性腫瘤的侵襲轉移的一個原因[6-7]。本研究通過分選人胰腺癌的干細胞，分析microRNA-200c的表達與作用，研究成果作以下報道。

1 材料與方法

1.1 材料

人胰腺癌的PANC-1細胞株（上海生物化學與生物學研究所）。NOD/SCID鼠（北京華阜康生物科技股份有限公司）。3450 Transwell小室（北京明陽科華生物科技有限公司）。抗人CD24-PE、CD44-APC、ESA-FITC流式熒光抗體（BD公司，美國）。流式細胞儀（貝克曼庫爾特公司，美國）。熒光定量PCR儀（7700，Applied Biosystems公司，美國）。PCR擴增試劑盒（生工生物工程股份有限公司）。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）。轉染試劑盒劑（Ambion公司，美國）。

1.2 腫瘤干細胞的分選

選擇處于生長期的PANC-1細胞數對，先使胰酶消化，后進行離心5 min。DMEM的培養液進行重懸，并將濃度調整至1×106個/ml。以1 ml的細胞懸液配20 μL的抗人CD24-PE、CD44-APC、ESA-FITC，置于常溫避光孵育處理30 min，高速離心機下進行8 min離心，分離上清液，并經過磷酸鹽溶液清洗后重新制作成單細胞的懸液。完成懸液制作后采用流式細胞儀對各成分比例進行檢測并分選[7-8]。

1.3 成瘤能力分析與細胞轉染

將新鮮分選后對抗人CD44+ESA+CD24+細胞與PANC-1細胞計數，并隨機選取20只NOD/SCID鼠隨機分兩組，每組各10只，每只NOD/SCID鼠皮下接種5×105個細胞。觀察分析NOD/SCID鼠成瘤能力。后將microRNA-200c前體片段以及陰性的對照片段轉染到NOD/SCID鼠的干細胞中。

1.4 microRNA-200c表達檢測

重新對PANC-1細胞、轉染microRNA-200c前體片段后NOD/SCID鼠胰腺癌的干細胞等進行分選，對細胞的總RNA進行提取并反轉錄成cDNA。

cDNA合成采用特異性引物microRNA-200 RT對反轉錄的體系進行構建，并以cDNA為模板，利用microRNA-200c特異性引物進行PCR的擴增，并利用PCR擴增試劑盒分析ct值，取得PCR擴增結果。

1.5 統計學方法

研究采取SPSS 16.0統計學軟件進行分析。其中計量資料采用（進行表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NOD/SCID鼠胰腺癌干細胞分選結果

NOD/SCID鼠的瘤移植驗證PANC-1細胞中分選胰腺癌干細胞具腫瘤干細胞的特性，瘤移植鼠的皮下胰腺癌干細胞瘤體積（1673.56±258.77）mm3大于移植同期的PANC-1細胞瘤體積（482.41±96.44）mm3。

2.2 microRNA-200c表達與侵襲能力

NOD/SCID鼠microRNA-200c表達量上，胰腺癌干細胞表達值（0.14±0.01）%低于PANC-1細胞表達值（0.98±0.11）%，microRNA-200c前體片段轉染后24 h，胰腺癌干細胞中microRNA-200c表達量為3.52±0.51，高于轉染陰性對照（0.24±0.19）%。平均穿膜的細胞數上，胰腺癌干細胞（311.00±6.93） 個 多 于 PANC-1細 胞（73.00±17.11） 個，microRNA-200c前體片段轉染后24 h，microRNA-200c轉染胰腺癌干細胞平均穿膜的細胞（80±12.63）個，而轉染陰性對照為（309±13.53）個。轉染microRNA-200c前體片段后，胰腺癌干細胞microRNA-200表達量上升，平均穿膜的細胞數上明顯降低（P＜0.05）。

3 討論

本研究通過對人的胰腺癌細胞系在PANC-1中進行分選，獲得抗人CD44+ESA+CD24+細胞，并接種NOD/SCID鼠進行瘤移植實驗，實驗結果驗證PANC-1細胞中分選胰腺癌干細胞具腫瘤干細胞的特性，瘤移植鼠的皮下胰腺癌干細胞瘤體積（1673.56±258.77）mm3大于移植同期的PANC-1細胞瘤體積（482.41±96.44）mm3。而通過細胞體外侵襲的能力檢測發現，轉染microRNA-200c前體片段后，胰腺癌干細胞microRNA-200c表達量上升，平均穿膜的細胞數上明顯降低，胰腺癌的干細胞侵襲能力遠比PANC-1細胞更高，研究表明了胰腺癌干細胞參與到胰腺癌侵襲過程。

綜上所述，microRNA-200c在胰腺癌干細胞中的表達降低，microRNA-200c能夠對胰腺癌的干細胞生長與減弱侵襲起到抑制的作用。

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