轉基因作物對魚類的生態毒理效應研究綜述

董姍姍,章嫡妮,張振華,于賜剛,劉燕,#,王長永,*

1. 環境保護部南京環境科學研究所，南京 210042 2. 環境保護生物安全重點實驗室，南京 210042

轉基因作物潛在的健康和環境風險一直以來頗受爭議，外源基因的隨機插入可能會影響轉基因作物本身內源基因的表達，進而產生非預期效應，例如：改變作物中的大量元素、微量元素、抗營養因子或固有植物毒素的表達水平[1-2]。如果作為動物飼料的轉基因作物發生了這些改變，可能會對動物的健康產生潛在影響，而且有研究發現轉基因作物在加工成飼料后其中的外源蛋白會有一定量的殘留，可能會誘導動物產生免疫應激反應[3]，影響動物的生長發育、繁殖等[4]。

目前對轉基因作物的飼用安全性評價多參照經典的生態毒理學評價方法，采用不同的飼喂時間、不同的劑量水平、不同的模式動物和毒性參數(表1)。Kuiper和Kleter[5]建議對于轉基因作物飼用安全性全面深入的評估應該包括對外源蛋白的毒性、致敏性，外源基因的分子特征、非預期效應及其水平轉移到其他物種的潛力等方面的評估。以往對轉基因作物飼用安全性的研究中因轉基因作物的品種、劑量水平、動物種類、實驗持續時間、對照組的選擇以及評價參數的不同，其結果會明顯不同[6-13]，這在一定程度上表明轉基因作物飼用安全性評價的復雜性，需要個案分析。

魚類是水體中主要生物之一,是水生脊椎動物的代表, 因其對水環境的物理、化學及生物變化比較敏感,已被廣泛應用于指示水環境質量的變化。目前以魚類為模式動物的生態毒理學研究主要是水體中農藥、抗生素、重金屬以及其他化學品等有毒物質的毒理效應,轉基因作物對魚類的安全性研究相對較少,國外在這方面的研究中較多使用的實驗動物是大西洋鮭(Salmosalar)、虹鱒魚(Oncorhynchusmykiss)和斑馬魚(Daniorerio)等[14]。常見的方法是配制含有一定劑量的轉基因作物飼料給魚喂食一段時間，評估魚的健康狀況。常見的毒性參數為魚的生長率、死亡率、健康指數、臟器功能及發育、組織病理學指標、血液學指標、臟器組織中抗氧化酶活性及敏感蛋白的mRNA表達水平等。

隨著集約化水產養殖業的發展，魚用人工配合飼料的應用也日漸廣泛，魚粉的需求量激增，由于受全球性的酷漁濫捕及環境污染等影響，魚粉的產量逐年下降，植物性來源諸如大豆和玉米在魚飼料中的應用越來越普遍。自1996年轉基因作物商業化種植以來，其產量相對于作物總產量的比例逐年增加。在2014年，轉基因大豆、棉花、玉米和油菜的種植面積分別占比為82%、68%、30%和25%[15]。轉基因作物是否與傳統作物具有一樣的營養成分，其中的外源基因及其表達蛋白是否會對魚類生長、健康產生潛在風險逐漸成為魚類養殖業關注的焦點。本文基于轉基因作物作為魚飼料原料對魚類生態毒理學效應的研究現狀，綜述了轉基因作物對魚的生長表現、生理生化、臟器功能及發育、組織病理以及行為活動等方面的生態毒理學效應，分析了當前研究中存在的問題，并對今后的研究趨勢進行了探討。

1 轉基因作物對魚類的生態毒理效應(Ecotoxicological effects of genetically modified crops on fish)

目前以魚類作為模式動物進行轉基因作物飼用安全性評價的研究還比較少，而且這些研究選取的魚的種類、評價的毒性參數、采用的轉基因作物品種及其在飼料中的含量，以及實驗持續的時間都有所不同，其結果也不盡相同。

1.1 對生長表現的影響

檢測魚的體重、體長、外形指數、特定增長率等生長指標是評價轉基因作物生態毒理效應的基本手段。例如：Sissener等[8]通過喂食斑馬魚含有25%轉基因大豆和20%轉基因玉米的人工飼料，調查了斑馬魚的攝食量、體重、體長和特定增長率等生長指標，結果顯示與非轉基因玉米組相比，轉基因玉米組斑馬魚體重顯著偏高。Sanden等[6]用含有19%轉Bt基因玉米的飼料喂食兩代斑馬魚，研究發現轉基因玉米組親代斑馬魚的各項生長指標與非轉基因玉米組相比沒有顯著差異，但轉基因玉米組子代斑馬魚的體重、特定增長率和食物轉化率都明顯高于非轉基因玉米組的，總體來看，喂食轉基因玉米飼料的兩代斑馬魚在生長表現上都好于喂食非轉基因玉米飼料的，推測這可能與非轉基因玉米中的伏馬毒素B1和黃曲酶毒素B1的含量相對偏高有關。Hemre等[16]在對大西洋鮭喂食轉基因玉米(MON810)飼料82 d的研究中發現，轉基因玉米組的攝食量、生長率和最終體重與非轉基因玉米組相比都顯著偏低。Brown等[17]分別以2種抗除草劑轉基因油菜(GT200和GT73)為飼料原料喂食虹鱒魚，實驗中設置5%～20%這4個劑量梯度，以非轉基因親本材料和不含油菜的飼料為對照，研究發現GT200轉基因油菜組虹鱒的體重、食物轉化率、蛋白效率比和蛋白沉積與非轉基因組相比無顯著差異，但CT73組虹鱒的體重增加值、食物轉化率和蛋白效率比隨著轉基因油菜在飼料中含量的增加而減少，而且與非轉基因親本組相比CT73組虹鱒魚身體中蛋白、水分及蛋白沉積增加，脂肪含量減少，推測可能由于轉基因與非轉基因油菜仔本身蛋白含量和溶解度的差異所導致。Chainark等[18]以虹鱒魚幼魚為模式動物，通過3個月的喂養試驗評估轉基因大豆對其生態毒理效應，在該研究中設置了15%和30%共2種劑量水平，結果顯示虹鱒魚的生長和攝食在轉基因大豆和非轉基因大豆組間沒有顯著差異。Li等[19]通過8周的喂養實驗評估了4種轉基因棉花對斑點叉尾鮰的生態毒理效應，實驗中以非轉基因親本和商業化的飼料為對照，棉花籽在飼料中的含量均為20%，通過對斑點叉尾鮰的生長、存活、飼料轉化率和魚體的成分分析，結果顯示Bollgard×Roundup Ready和BollgardⅡ×Roundup Ready組斑點叉尾鮰的蛋白含量與非轉基因親本相比顯著偏低。

表1 轉基因作物對魚類的生態毒理學效應Table 1 Ecotoxicological effects of genetically modified (GM) crops on fish

1.2 對生理生化方面的影響

1.2.1 血液學

血液學參數已被廣泛地用來評價魚類的健康狀況、營養狀況及對環境的適應狀況，是重要的生理、病理和毒理學指標[20]。研究顯示飼料的配比、添加劑、傳染病以及環境因子脅迫等都可能對魚的血液參數產生影響[21-22]。在轉基因作物對魚類的生態毒理學研究中已有很多采用血液學指標來監測魚體的生理變化。例如：Sagstad等[23]發現喂食轉基因玉米的大西洋鮭血液中的粒細胞與非轉基因玉米組的相比比例明顯偏高，推測可能是轉Bt基因玉米引起了與細胞應激反應相關的免疫反應變化。J?rgensen[24]用含有19%抗蟲轉基因玉米的飼料喂食斑馬魚45 d，對白細胞的數量檢測發現轉基因玉米組與其非轉基因近等系對照組間沒有顯著差異。血液指標的改變在一定程度上指示了生物機體的功能變化，通過檢測血漿中營養素和酶的含量可以對魚進行健康篩查，比較不同實驗組間的營養水平。一項用分別含有15%和30%的轉基因大豆的飼料喂食大西洋鮭28 d的研究發現，轉基因大豆組大西洋鮭血漿甘油三酯水平與非轉基因大豆組相比顯著偏低，推測可能是由于2種大豆中皂苷水平的差異所導致[25]。Sanden等[26]喂食幼年大西洋鮭含有抗除草劑轉基因大豆的飼料8個月，結果也發現轉基因大豆組的大西洋鮭與常規大豆組相比血漿甘油三酯顯著偏低。同樣一項用含有轉基因大豆的飼料喂食大西洋鮭7個月的研究顯示，大西洋鮭血漿中的血糖和蛋白質含量在轉基因和非轉基因大豆組間沒有顯著差異，但轉基因大豆組血漿甘油三酯濃度相對于非轉基因大豆組偏高，與前人的研究結果剛好相反，這種差異表明很有可能不是轉基因的效應引起的，而與不同品種大豆中的抗營養因子、抗原、代謝產物或者其他未知因素的差異有關[27]。丙氨酸轉氨酶(ALAT)和天冬氨酸轉氨酶(ASAT)主要存在于動物肝臟、心臟和骨骼肌組織細胞內，當細胞膜完整時它們在血漿中的含量較低，當組織細胞受到損傷或壞死時血漿中的含量升高，血漿中ALAT和ASAT的含量可以作為診斷魚肝臟和腎臟疾病的指標。例如：通過對不同飼料組大西洋鮭血漿中ALAT和ASAT含量的檢測，比較研究轉基因大豆對大西洋鮭臟器的影響[26]。

1.2.2 敏感基因和蛋白

分子生物標志物直接反映外界因素與細胞靶分子，特別是生物大分子如核酸和蛋白質的相互作用及其后果，具有較高的敏感性。目前，在轉基因作物對魚類生態毒理效應研究中應用較多的分子指標主要是與免疫應激反應相關的熱休克蛋白、抗氧化酶及其mRNA轉錄水平。

熱休克蛋白(HSPs)是一類在遺傳上高度保守的分子，能保護細胞并促進細胞對各種刺激所造成的損傷進行自身修復，具有重要的生物學功能。在不受脅迫的細胞中它們能夠維持蛋白質的穩態,參與細胞內新合成蛋白質的折疊、加工和轉運；在有脅迫因子存在的情況下HSPs會被誘導合成,保護細胞免受損傷。研究顯示魚肝臟中的熱休克蛋白似乎對外界環境的刺激更加敏感[28]。例如：Sagstad等[23]等發現喂食大西洋鮭轉基因玉米飼料82 d，其肝臟中的HSP70蛋白含量與魚粉對照組相比顯著偏高，而非轉基因玉米組的處于中間水平，HSP70的mRNA轉錄水平在各組間沒有顯著差異。Sissener等[8]通過20 d的喂養實驗，調查了抗蟲轉基因玉米對斑馬魚肝臟中HSP70 mRNA轉錄水平的影響，結果顯示非轉基因組斑馬魚肝臟中的HSP70 mRNA轉錄水平比轉基因玉米組的高出6.5倍，盡管統計上不顯著。

1.3 對臟器功能及發育的影響

臟器系數是毒理實驗中常用的檢測指標，臟器系數的變化可以在一定程度上反映動物臟器的受損情況，為我們比較實驗組與對照組間的差異提供線索。已有大量研究通過調查魚的肝臟、脾臟、腎臟或腸道等臟器系數及臟器功能，監測轉基因作物對魚類的生態毒理效應[4,25,27,35]。例如，Sagstad等[25]和Hemre等[36]在用抗除草劑轉基因大豆配制的飼料喂食大西洋鮭時都發現，轉基因大豆組的大西洋鮭脾臟系數相對于非轉基因大豆組的顯著偏高，推測可能與白細胞的激活和增殖有關，這是機體在受到外界抗原刺激后普遍的免疫反應。在一項同樣是喂食大西洋鮭轉基因大豆飼料的研究中，對大西洋鮭的臟器系數和功能檢測發現轉基因組與非轉基因組的脾臟系數相似，但轉基因大豆組的中腸系數與非轉基因對照組相比顯著偏低[27]。

腸道是營養物質消化吸收的重要器官，在轉基因作物對魚類的生態毒理學研究中，通常會把腸道中的消化酶活性作為監測指標之一。Bakke-McKellep等[35]用含有抗除草劑轉基因大豆的飼料對大西洋鮭幼魚進行8個月的喂養實驗，對不同腸道片段中的消化酶活性、活性葡萄糖攝取和鈉-葡萄糖共轉運蛋白1(SGLT1)水平的檢測結果顯示，轉基因大豆組大西洋鮭幽門垂中的葡萄糖轉運率和SGLT1蛋白水平顯著偏高，非轉基因大豆組的處于中間水平，而魚粉組的最低。與非轉基因大豆組相比，轉基因大豆組大西洋鮭幽門垂中的麥芽糖酶活性明顯偏低。一項用分別含有15%和30%轉Bt基因玉米(MON810)的飼料喂食大西洋鮭的研究發現，轉基因玉米組大西洋鮭中腸片段的麥芽糖酶活性顯著偏高，幽門垂中的葡萄糖攝取量也顯著偏高[16]。Gu等[37]通過99 d的喂養實驗調查了轉Bt基因玉米(MON810)對大西洋鮭消化功能的效應，結果顯示轉基因組大西洋鮭腸道中亮氨酸氨基肽酶和麥芽糖酶活性顯著降低，而且腸道中的膽汁鹽濃度也明顯偏低，該研究表明轉基因玉米中的Cry1Ab蛋白或其他成分上的差異可能會引起大西洋鮭幼魚腸道反應的變化。

1.4 對組織病理學指標的影響

組織病理參數是生態毒理學研究中的重要指標之一，目前在轉基因作物的飼用安全性評價中也已廣泛應用。Sissener等[7]對喂食了7個月轉基因大豆飼料的大西洋鮭的脾、頭腎和中腸的組織形態檢測發現，轉基因大豆組與非轉基因大豆組大西洋鮭的組織形態沒有明顯差異，但兩組的所有樣本都出現了腸道炎癥，推測這可能與飼料中的大豆含量水平有關。在一項以幼年大西洋鮭為實驗動物，以含有12.5%抗除草劑轉基因大豆的飼料為實驗組，以商業化的非轉基因大豆和魚粉飼料為對照組，喂食8個月的研究顯示2種大豆組大西洋鮭的腸道、脾臟、肝臟、心臟和腦的臟器系數沒有顯著差異，在對腸道的進一步研究中發現，非轉基因大豆組腸道組織中增殖細胞核抗原(PCNA)陽性細胞增加，而且與魚粉組相比，2種大豆組都明顯提高，這可能是大豆中的抗營養因子誘導的炎癥反應引起的，各組腸道中的溶菌酶水平和免疫球蛋白M沒有顯著差異[38]。在對喂食了轉基因玉米飼料的子一代斑馬魚的近端小腸和中腸組織病理的研究中發現，轉基因玉米組和非轉基因玉米組都有個別樣本的腸道形態發生了輕微變化，而且轉基因玉米組有一個樣本的中腸出現了輕微炎癥，但總體來看，兩組腸道樣本的組織病理沒有顯著差異[6]。

1.5 對行為活動的影響

行為參數主要反映較低生物水平的影響,包括環境激素物質、有毒有害的有機與無機物、環境因素變化等引起的生物生理習性、健康狀態異常變化,從而確定其中的相關關系。已有研究發現魚在卵黃囊時期活動的增加可能會影響其進一步的生長發育[39]，在轉基因作物對魚類的飼用安全性研究中大多是通過監測魚的游動情況來評估轉基因作物的生態毒理效應。例如：Sanden等[6]在研究轉Bt基因玉米對兩代斑馬魚的效應時，采用ZebraLab斑馬魚行為學分析系統監測孵化出4 d的子一代斑馬魚的游動軌跡，通過高分辨率數字紅外相機捕捉斑馬魚在特定區域的游動時間，結果發現轉基因組與非轉基因組斑馬魚在高度活躍區域的時間相似，轉Bt基因玉米對斑馬魚幼魚的游動情況沒有顯著影響。

從以上研究可以看出，轉基因作物作為飼料成分對魚類的生態毒理效應研究缺乏重復性，針對不同的實驗動物、設置不同的飼料配比或者采取不同的喂養時間其實驗結果不同，甚至可能是相反的，這表明在這些研究中所檢測到的效應很有可能不是轉基因及其表達蛋白所引起的，但有可能與轉基因的非預期效應有關，因為轉基因可能導致作物中的抗營養因子水平、抗原、代謝產物或者其他不確定因素的變化。目前，轉基因作物對魚類的生態毒理效應研究中，已調查了大量的與魚類生長表現、生理生化、臟器功能及發育、組織病理以及行為活動等相關的參數指標，總體來看轉基因的效應很小，只要在合理含量范圍內轉基因作物與傳統作物一樣適合作為飼料來源。

2 存在的問題(Problems)

(1)實驗動物的選擇：目前在轉基因作物對魚類的生態毒理效應研究中應用的最廣泛的實驗動物是大西洋鮭，此外還有斑點叉尾鮰、虹鱒和斑馬魚等。但是對于某些種類的魚，特別是像大西洋鮭這種肉食性魚類，對某些植物成分非常敏感(例如：大豆中的抗營養因子)，用其作為轉基因作物飼用安全評估的實驗動物頗有爭議，因此，針對同種轉基因作物選用不同的實驗動物進行廣泛的評估是有必要的。

(2)轉基因效應的確定：在轉基因作物對魚類的飼用安全性研究中，盡管可以保證不同飼料組在飼料配比上是一致的，但是并不是飼料中的所有成分都會被分析，日糧成分上的某些差異是很難平衡的，例如植物雌激素或者皂苷等抗性因子的差異，或者是霉菌毒素、除草劑等農藥殘留的差異。在實驗中檢測到的不同飼料組在某些響應參數上的差異，很大程度上還很難確定是否是轉基因的效應引起的。而且這些差異通常都是孤立的，缺乏重復性的，差異的大小是否具有重要的生物學意義還需要進一步的跟蹤研究。

(3)響應參數的選擇：轉基因作物的飼用安全評價不僅需要調查魚的生存、生長、繁殖等一般性指標，還應該包括能夠評估魚的健康水平以及對飲食的不良反應進行早期監測的敏感指標。但并不是檢測的響應參數越多越能反應轉基因的效應，當許多不同的參數被檢測時，其中某幾個參數很有可能會出現顯著差異，這些差異往往很難解釋，而真正的效應可能由于實驗設計等原因沒有被檢測出來。因此，選擇合適的響應參數來監測轉基因作物對魚類的生長、繁殖和健康的影響，是轉基因作物生態毒理學效應研究中的關鍵。

(4)對照組的選擇：在大多數研究中，會選用與轉基因作物在相同條件下種植的非轉基因近等基因系作為對照，但是轉基因與非轉基因親本在組成成分及營養水平上的差異仍不可避免。在對照組的選擇上，存在的主要問題是如何解釋與對照組在某些參數上的差異，如何區分這種差異是由轉基因蛋白還是轉基因的非預期效應造成的，或者還是由于種植季節或地點的變化造成的隨機差異。針對這些問題，在實驗中選擇幾個商業化的非轉基因作物作為對照對于轉基因作物的安全性評估可能會更加全面和準確。

3 研究展望(Prospects)

目前，植物中哪種抗營養因子或成分及其在何種水平上會對魚的生長、健康產生不利影響，這方面的信息還比較匱乏。而且某些抗性因子間的相互作用會影響其抗性水平，使得更難預測對魚的效應。通過對轉基因作物與非轉基因作物內在成分(例如：抗性因子、霉菌毒素或農藥殘留等)差異的分析，可能會在一定程度上解釋不同飼料組間的反應差異，或者至少可以說明這些差異是轉基因的效應還是其他因素所導致的。此外，對于作物和飼料中轉基因及其表達蛋白的定量檢測也有助于區分轉基因的預期與非預期效應。采用非靶向性的篩選方法(如：基因芯片和蛋白質組學)分析轉基因作物在魚的靶標器官中的非預期效應也將在轉基因作物生態毒理學研究中發揮重要作用。

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