非致死劑量的四溴雙酚A脅迫下蚯蚓的生長和抗氧化防御反應

史雅靜，徐曉宇，王宇，韓雪松，李田春，王玉榮，史雅娟

1. 遼寧科技學院生物醫藥與化學工程學院 遼寧省生物醫藥與化學工程重點實驗室, 本溪 117004 2. 中國科學院生態環境研究中心 城市與區域生態國家重點實驗室，北京 100085

四溴雙酚A(tetrabromobisphenol A, TBBPA)是常用的溴化阻燃劑之一，被廣泛用于聚苯乙烯泡沫、電子產品和ABS樹脂等領域中[1]。由于TBBPA可通過制造業以及各種紡織和材料的處理或循環利用釋放到環境中，并且具有遷移性、蓄積性和持久性等特點[2]。TBBPA在空氣、土壤、水體底泥等多種環境介質、海鳥和魚體內、甚至人體血液和母乳生物樣品中存在[3-9]。TBBPA不僅在環境中能長期殘留，而且可以通過食物鏈和其他途徑在人體內富集，長期接觸會妨礙大腦和骨骼的發育，并且可能致癌[10-12]，因此引起日益廣泛的關注。

利用蚯蚓作為研究污染物對土壤生物影響的指示生物，可以間接反映環境中污染物的污染強度。經濟合作與發展組織(OECD)等機構已將蚯蚓(赤子愛勝蚓)作為標準試驗動物。蚯蚓體內多種酶系能夠被污染物誘導或激活，可在生化水平上對污染暴露做出敏感響應[13-15]。近幾年，國內外關于TBBPA對水生生物毒性的研究報道頗多[16-21]，但以土壤生態系統中的生物進行的毒理研究尚少，其中以蚯蚓作為模式生物進行毒理研究的，多數是采用濾紙接觸法和人工土壤法并且以急性暴露(48 h 或14 d)為主[22],而污染物對蚯蚓的亞急性(28 d)、慢性毒性(56 d以上)，因具有較好的生態相關性，且測試終點比急性的終點要敏感，而受到關注[23-24]。采用自然土壤法模擬蚯蚓生活的真實環境, 可比較真實地反映污染物在自然環境中對生物的實際影響，更好地對污染地區進行環境安全評價。

本實驗采用自然土壤暴露法，通過非致死劑量的TBBPA對蚯蚓的急性、亞急性暴露試驗，以蚯蚓的生長抑制率、體內蛋白質含量和抗氧化酶活性(SOD、GST)的反應變化，來揭示TBBPA的生態生理毒性，為TBBPA土壤生態風險評估提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試生物、化學品和土壤

赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)購自沈陽尊龍生物技術有限公司。選用2～3月齡，體重0.35～0.45 g，生殖帶明顯且無損傷的成熟個體。實驗前用去離子水進行清洗。

四溴雙酚A(TBBPA)(CAS No.79-94-7), 純度為98%，購自梯希愛(上海)化成工業發展有限公司(中國)。

供試清潔自然土壤采自山東省濰坊市荒地，實驗前，對土壤進行風干，過10目篩。經測定該土壤樣品pH值為8.68，有機質含量1.08%，全N為0.03%,TBBPA未檢出，重金屬含量低于國家土壤環境質量一級標準。

1.2 暴露方法

蚯蚓暴露于添加不同濃度TBBPA的清潔自然土壤中，將一定量的TBBPA溶于少量丙酮并均勻拌入土壤中，TBBPA濃度梯度根據預實驗所確定的非致死劑量設定，各處理TBBPA含量依次為：0、50、100、400 mg·kg-1(以干重計，下同)，用去離子水調節土壤濕度為25%，置于通風廚中使丙酮完全揮發干凈。

暴露方法參照人工土壤標準暴露法(OECD Guideline No.207)[25]并加以適當修改。暴露試驗前，赤子愛勝蚓在供試清潔土壤中馴養24 h，用去離子水清洗干凈后置于放有潮濕濾紙的培養皿中(黑暗環境、(20 ± 1) ℃、24 h)，去除消化系統內容物。隨機挑選10條蚯蚓放入裝有750 g濕土的1 000 mL燒杯中，放置于人工氣候箱。控制條件為：溫度(20±1) ℃，相對濕度80%～85%，24 h連續光照，光照強度400～800 lux。試驗包括急性期(0～14 d)和亞急性期(15～28 d)2個階段，分別在4、7、14、21、28 d進行稱重。在14 d、28 d時從每個重復中隨機挑選蚯蚓2條，進行蛋白含量和酶活性測定。設空白(CK，僅加水)和溶劑空白(CKs，丙酮含量為0.02%)對照組。每個處理4個重復。

1.3 生長抑制率測定

將暴露于不同劑量TBBPA中，第4、7、14、21和28 天的蚯蚓平均體重與其在試驗開始時的平均體重相比較，采用公式In=(W0-Wt)×100%/W0計算生長抑制率[26]，其中，In是不同處理的蚯蚓的生長抑制率，W0是試驗開始時蚯蚓的平均體重(mg)，Wt是第t天蚯蚓的平均體重(mg)。

1.4 蛋白質含量和酶活性測定

1.4.1 粗酶液制備

將經過染毒處理的蚯蚓，洗凈，稱重，低溫勻漿，在4 ℃下以4 000 r·min-1離心30 min，取上清液按1:4(V:V)稀釋后，用于蛋白質含量、GST酶活性、SOD酶活性測定。

1.4.2 蛋白質含量與酶活性測定方法

蛋白質含量采用考馬斯亮藍方法測定[27]，使用牛血清蛋白作為參考標準蛋白，以595 nm下的吸光度值計算蛋白含量，單位為mg。GST酶活性測定參考文獻[28-29]中的方法，以340 nm下吸光度值計算酶活性，單位為nmol·min-1·mg-1pro(以protein計)；超氧化物歧化酶(SOD)活性測定，采用氮藍四唑法[30]，以560 nm下的吸光度值計算酶活性，單位為U·mg-1pro，以50%抑制率的酶量為一個酶活力單位。

1.5 數據處理

在滿足正態分布或對數正態分布(Shapiro-Wilk test)和方差齊次(Levene’s test)的前提下，采用單因素方差分析(ANOVA)，多重比較采用LSD，與對照比較時P<0.05為顯著性差異。所有統計均采用SPSS18.0軟件完成。

2 結果(Results)

2.1 TBBPA對蚯蚓生長的抑制

赤子愛勝蚓暴露于TBBPA后的4 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d的生長抑制率如圖1所示。統計分析顯示對照空白(CK)和溶劑空白(CKs)之間并沒有顯著差異，說明經過揮發后的殘余丙酮對赤子愛勝蚓并沒有產生影響。隨著暴露時間的延長，空白對照(CK)的生長抑制率表現上升的趨勢，可能是由于土壤中營養物質的消耗而造成營養不足，以致體重下降。

TBBPA暴露急性期(0～14 d)，隨著TBBPA濃度增大，蚯蚓生長抑制率增大并在400 mg·kg-1處理組達到最大(21.48%)。TBBPA暴露的亞急性期(14～28 d)也有相同的規律。相同的TBBPA暴露濃度，隨著TBBPA暴露時間增長，蚯蚓生長抑制率逐漸增大且均在28 d時達到最大，28 d的400 mg·kg-1處理組的生長抑制率最大(33.02%)。經檢驗，5次生長抑制率數據滿足進行方差分析的前提條件，所以采用方差分析法來分析不同濃度處理之間差異的顯著性，結果表明在0～14 d 的急性試驗期間TBBPA對蚯蚓的生長抑制情況均存在顯著的劑量效應關系，而在亞急性暴露期(14～28 d)各處理的生長抑制率不具有顯著性差異。(4 d:F=4.708,P= 0.014；7 d:F=3.954,P= 0.026；14 d:F=10.037,P= 0.001；21 d:F=2.469,P=0.112；28 d:F=21.743，P=0.217)。多重比較(LSD test)進一步表明了在各暴露時期高濃度(400 mg·kg-1)處理組與空白和其他濃度組相比都顯著抑制蚯蚓的生長(P<0.05)。

2.2 TBBPA對蚯蚓體內蛋白含量影響

TBBPA對蚯蚓體內蛋白含量影響如圖2所示，TBBPA暴露急性期(14 d)，蚯蚓體內的蛋白含量在對照組水平上下波動, ANOVA 分析表明蚯蚓體內蛋白含量在各處理間不存在顯著性差異(P=0.712)。進入TBBPA暴露的亞急性期(28 d)，蚯蚓體內的蛋白質含量，在50 mg·kg-1染毒組減少，然后隨著TBBPA濃度的增加而增加，并且到400 mg·kg-1染毒組時達到最大值，方差分析表明處理組之間存在顯著性差異(P=0.039)。

圖1 不同濃度的四溴雙酚A(TBBPA)對蚯蚓的生長抑制率Fig. 1 Growth inhibition rates of earthworms exposed to tetrabromobisphenol A (TBBPA) at different concentrations

圖2 不同濃度的TBBPA對蚯蚓體內蛋白質含量影響Fig. 2 Effects of TBBPA at different concentrations on protein contents of earthworms

圖3 不同濃度的TBBPA對蚯蚓體內SOD酶活力的影響Fig. 3 Effects of TBBPA at different concentrations on SOD activities of earthworms

圖4 不同濃度的TBBPA對蚯蚓體內GST酶活力的影響Fig. 4 Effects of TBBPA at different concentrations on GST activities of earthworms

2.3 TBBPA對蚯蚓體內SOD酶活性的影響

TBBPA對赤子愛勝蚓SOD酶活性的影響如圖3所示。TBBPA暴露急性期(14 d)，數據分析顯示對照(CK)和溶劑空白(CKs)之間SOD酶活性并沒有顯著差異，所有TBBPA染毒組SOD酶活力均顯著高于空白對照組，其中在50 mg·kg-1處理組顯著高于中、高濃度(100 mg·kg-1、400 mg·kg-1)處理組，隨著濃度增加，SOD酶活略有下降，但都高于對照組。

隨著暴露時間的延長，空白對照(CK)和溶劑空白(CKs)的SOD酶活性有所升高。TBBPA暴露亞急性期(28 d)，各染毒組蚯蚓體內SOD 酶活性與對照組之間仍具有顯著性差異(ANOVA,P=0.029)。低、中濃度(50 mg·kg-1、100 mg·kg-1)處理組與空白對照沒有顯著性差異，但高濃度400 mg·kg-1處理組SOD酶活性顯著升高(LSD檢驗，P<0.05)。

2.4 TBBPA對GST酶活性的影響

TBBPA對赤子愛勝蚓GST酶活性的影響如圖4所示。TBBPA暴露急性期(14 d)，統計分析顯示對照空白(CK)和溶劑空白(CKs)與低濃度染毒組(50 mg·kg-1)之間GST酶活性并沒有顯著差異，100 mg·kg-1染毒組開始有上升趨勢，直到400 mg·kg-1組GST酶活性才出現顯著誘導效應(ANOVA,P=0.039)。TBBPA暴露亞急性期(28 d)，各處理組GST酶活性與對照無顯著差異(ANOVA，P=0.428)。

3 討論(Discussion)

傳統的蚯蚓生態毒理學研究多采用標準的濾紙接觸法或人工土壤法。濾紙接觸法暴露時間短(24～48 h)，可對受試物毒性進行初篩，初步了解蚯蚓的潛在毒性，但僅反映了化學品經皮膚暴露一種途徑對蚯蚓的影響，很難評估其對蚯蚓的真實影響。人工土壤法可較好地模擬蚯蚓生活的真實環境，能夠體現皮膚、消化道2種暴露途徑的影響，但由于實驗導則中沒有就人工土中有機質含量進行明確規定，不同批次土實驗中有機質含量常有一定差異[31]，從而降低了各批次人工土壤法實驗之間的可比性；而且自然土壤有很多未知因素，污染物也是長期存在的[32]，自然土壤性質和結構與人工土壤仍有一定差異，對污染物的毒性均有較大影響，采用人工土壤暴露的結果表征污染物的生態風險可能會有較大的誤差。TBBPA作為類似于“POPs”的潛在環境內分泌干擾物，目前還缺乏自然土壤生態環境的急性、亞急性毒性數據，因此本文采用自然土壤法進行TBBPA毒性暴露實驗所獲得的數據可以作為一種補充和參考，以更好地對污染地區進行環境安全評價。

本文研究了非致死劑量的TBBPA經急性和亞急性暴露對赤子愛勝蚓生長、蛋白質含量和抗氧化酶活性的影響。采用非致死劑量在亞急性試驗條件下進行暴露，更能反映出蚯蚓在接近真實環境中毒性反應[26]。非致死濃度梯度是根據急性試驗得到半致死濃度而確定的，確保蚯蚓在整個試驗過程中無死亡或死亡率低于10%，本試驗的死亡率低于10%符合OECD標準。

生物量變化是聯系化學脅迫、化學效應與能量動態變化的[33]。CK和CKs組蚯蚓在實驗前期(0～7 d)的生長抑制率均為負值，在14 d的生長抑制率也低于10%，表示蚯蚓在此條件下可以正常生長；CK和CKs組在亞急性期的生長抑制率增加，體重下降可能因為亞急性試驗過程中只依靠自然土壤中營養物質，其不足以滿足蚯蚓生長的需要，因此，在亞急性期時，可以適當增加有機質以補充營養物質的不足。

在試驗范圍內，急性期間，TBBPA沒有使蚯蚓死亡，卻顯著抑制蚯蚓生長，隨著TBBPA暴露濃度增大，暴露時間延長，生長抑制率逐漸增大；進入亞急性期時，受到TBBPA脅迫的蚯蚓體重進一步下降，生長抑制率持續增大，與空白對照之間不具有顯著性差異，此時蚯蚓體重的下降可能更多的是受土壤營養物質缺乏的影響。實際上蚯蚓受TBBPA脅迫而體重下降是一個綜合過程，蚯蚓持續受到TBBPA脅迫時，會減少食物的攝取，TBBPA的吸收隨之減少，同時攝入體內的有限能量更多地應用于解毒過程的代謝消耗，而對影響蚯蚓存活的非必要功能如生長、繁殖功能則受到抑制，導致體重下降[26]。

在TBBPA暴露急性期(14 d)，蚯蚓蛋白質含量與空白對照無顯著性差異。這可能是由于TBBPA在微生物的作用下部分降解，蚯蚓表現出一定的適應性，而此時影響蛋白質含量的主要是腸組織，其吸收得比較少，所以蛋白質含量僅在空白組水平上下波動，基本上沒有變化。然而進入TBBPA暴露亞急性期時(28 d)，蚯蚓蛋白含量在低濃度組顯著減少，后逐漸增加，在TBBPA 400 mg·kg-1時達到最大值。這種變化規律可能是由于蚯蚓暴露在TBBPA中，低濃度TBBPA的長時間刺激，使蚯蚓做出反應相對較少，體內蛋白質含量有所減少，但當隨著TBBPA濃度的增加到一定程度，并長時間刺激以后，且土壤中的TBBPA降解產物的毒性比較大[9, 34]，在大分子TBBPA和其小分子降解產物對蚯蚓的共同作用下，并且相當一部分產物被腸組織吸收，吸收量比較大，使得腸組織會做出相應的反應，刺激體內的蛋白質和酶分泌增加，以緩解外來刺激作用。蚯蚓面對外來刺激做出相應的反應，體壁組織和腸組織分泌的蛋白質和一些酶會增加，從而起到自我保護的作用[32]。

已有的TBBPA對蚯蚓毒性效應的研究顯示，TBBPA對蚯蚓抗氧化酶活性具有誘導效應[35]。SOD催化超氧陰離子自由基變成過氧化氫和氧氣。在本研究中TBBPA暴露急性期(14 d)，各染毒組與對照空白組相比均有顯著差異，并且SOD酶活性在染毒組50 mg·kg-1達到最大值(P<0.01)。一般認為，當蚯蚓受到輕度環境脅迫時，體內SOD酶活性往往有所提高，而當受到重度逆境脅迫時，SOD酶活性通常下降[33, 36]。這與利用人工土壤研究TBBPA對蚯蚓SOD基因表達,證明低濃度TBBPA對SOD基因表達水平有誘導效應的結果[33]相一致。進入TBBPA暴露亞急性期時，蚯蚓體內的SOD酶活性隨著TBBPA的增加，總體上表現為上升的趨勢。在TBBPA脅迫損害下，破壞蚯蚓體內的代謝平衡，引起代謝產物的積累，并產生過量的能產生氧化損傷的活性氧等有害物質。因此蚯蚓通過啟動防御系統如誘導SOD酶活性來抵御和清除這些物質，以保持機體內部動態穩定平衡。

GST催化谷胱甘肽和外源親電子基團結合并將產物移出體外。與對照組相比，400 mg·kg-1染毒組中GST活性基因表達量出現明顯誘導的現象[33]。我們可以推斷蚯蚓暴露在含有400 mg·kg-1TBBPA的土壤中，被誘導產生大量谷胱甘肽轉移酶來應對氧化脅迫。進入TBBPA暴露亞急性期時，染毒組與空白對照GST酶活性無顯著性差異，表明TBBPA毒性超過了蚯蚓的耐受范圍，對蚯蚓的機體造成了一定損傷。

本實驗中，TBBPA對蚯蚓的生長抑制情況，在急性試驗中均存在顯著的劑量效應關系，而在亞急性暴露期， 400 mg·kg-1時被顯著抑制蚯蚓的生長(P<0.05)；TBBPA對蚯蚓體內蛋白含量影響，在急性試驗中各處理間差異不顯著(P=0.712)，進入亞急性期蛋白質含量在400 mg·kg-1時被顯著誘導(P=0.039，P<0.05)；TBBPA對蚯蚓SOD酶活性的影響，在急性試驗中50 mg·kg-1時被顯著誘導(P<0.01)，在亞急性試驗中400 mg·kg-1時SOD酶活性顯著升高(P<0.05)；TBBPA對蚯蚓GST酶活性，在急性試驗中400 mg·kg-1時呈現顯著誘導效應(P<0.05)，在亞急性期各處理間差異不顯著(P=0.428)。蚯蚓生長抑制率、蛋白質含量、體內各生化酶系對TBBPA暴露的時間效應和劑量效應的敏感性存在不同程度差異，因而在土壤污染生態毒性診斷時，應依據污染暴露指示的有效性和敏感性選擇多時間段檢測和多指標聯合診斷。

土壤性質對污染物在土壤中的毒性程度具有重要影響。土壤有機質含量與疏水性有機物在土壤中的生物有效性密切相關，因而土壤有機質是對有機污染物在土壤中毒性影響的最重要因素，也是將人工土毒性實驗結果外推到自然土中的重要依據[37-39]，但含水量、土壤pH值和微生物活性等對污染物在土壤中的毒性也具有一定影響[39-42]。污染物在自然和人工土中具有不同的行為和生物可利用性[38, 43-45]，因而對土壤生物表現出不同的毒性，例如苯敵草在有機質含量高的人工土中吸附性強，對線蚓在人工土中的存活率和繁殖率都比在自然土中高[41]；而重金屬Zn在人工土中比在自然土壤的毒性強10倍，是由于人工土中的生物可利用性強[46]；DDT在有機質含量相當的自然土和人工土對蚯蚓存活的毒性差異接近2倍[47]，因而采用土壤有機質含量作為在自然土和人工土中外推的唯一標準常常引起較大偏差。

目前尚缺乏TBBPA在人工土和不同自然土壤中對蚯蚓的毒性的全面對比研究。本研究中TBBPA在自然土中經14 d暴露后對蚯蚓的生長抑制作用與有關人工土中TBBPA對蚯蚓生長抑制程度[33]相當，上述2個研究其他暴露條件相似，所用實驗介質的差異在于本研究所用的自然土壤有機質含量(1.08%)僅為人工土中的1/3，而偏堿性(pH值為8.68)土壤與中性的人工土差異較大。二者土壤性質差異較大但毒性卻相當，說明土壤有機質含量和土壤酸堿性對TBBPA在土壤中的毒性具有一定影響，土壤有機質含量作為TBBPA在自然土和人工土中外推的唯一標準將會引起偏差。

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