3種抗原修復方法對免疫組化染色效果的影響

鄭秋樺，李鈺湘，柯 野，張海明

（1.韶關學院英東生命科學學院，廣東韶關512005；2.廣州安必平醫藥科技股份有限公司，廣東廣州510663）

免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究.在免疫組織化學的試驗過程中，常采用固定石蠟包埋組織，然而組織在使用甲醛固定過程中，形成的醛鍵會封閉抗原的決定簇，影響抗體和抗原的結合，從而影響染色觀察結果；因此，對抗原的修復在免疫組織化學中就尤為重要［1］.不同的抗原修復方法對免疫組化染色結果產生不同的影響［2-3］.如加熱抗原修復技術既能保留福爾馬林固定石蠟包埋技術良好的組織學形態，又明顯提高抗原的檢出率，提供良好的IHC染色結果［4-5］；影響加熱抗原修復的因素主要包括修復的溫度、加熱的時間、熱源、抗原修復液的pH值等方面［1］.

本文采用控制變量法，探究在改良Tris-EDTA(PH9.0)修復試劑中，采用水煮、微波和高壓3種不同的熱修復方法對P53、P63、Ki67、CK5/6、CK7這5個抗體的免疫組化染色效果的影響.

1 材料與方法

1.1 試驗組織與試劑

1.1.1 試驗組織

由廣州安必平（LBP）醫藥科技股份有限公司提供的陽性組織材料.

1.1.2 試驗試劑

抗體試劑均由LBP公司提供的即用型產品（見表1）；環保透明脫蠟劑；無水乙醇；過氧化物酶封閉液（3%過氧化氫）；二抗試劑：LBP-VBrightI二抗HRP鼠兔通用型（一步法）；DAB顯色液（加強型）：1 mL DAB色原/20 mL DAB緩沖液；改良Tris-EDTA(PH9.0)濃縮液（50×）；Mayer’s蘇木素染液；PBS 緩沖粉：2 000 mL/包；Tween-20.

1.1.3 試劑的配制

DAB顯色液（加強型）：一滴DAB原液加入至1 mL DAB緩沖液中，該溶液易氧化，現配現用.

Tris-EDTA(pH9.0)修復液：改良Tris-EDTA(pH9.0)濃縮液（50×）40 mL加入1 960 mL的蒸餾水攪拌均勻.

表1 試驗所用抗體信息

PBS緩沖液：一包PBS緩沖粉加入蒸餾水2 000 mL攪拌至粉末全部溶解加入4 mL Tween20繼續攪拌至完全融合即可.

1.2 試驗設備

Thermoscientific切片機、武漢俊杰電子有限公司生物組織攤烤片機、微波爐、Leica DM500顯微鏡、Leica ICC50 HD Camera、蘇泊爾YS20ED 20 cm高壓鍋.

1.3 方法

1.3.1 組織蠟塊的切片與前期處理

將五種組織蠟塊-20℃冷凍，2～3 min后取出，打開空氣加濕器減少靜電作用，在切片機上連續切片（2μm），放入20%的酒精中展片，再使用防脫載玻片進行撈片，保證每張片撈的方向及位置一樣且盡可能在載玻片的中央處，以便閱片及效果對比.每個組織塊撈9片，在44℃熱水中進行攤片使組織與載玻片平整粘附，無褶皺，60℃的烤片機上進行烤片至組織與載玻片較牢固結合，不會由于重力作用而出現移位，將載玻片轉至耐高溫塑料切片架后，放入烘片機進行55℃烘片2 h.

1.3.2 片子的脫蠟與水化

將已完成初步處理的片子放進通風櫥中的環保脫蠟劑（代替二甲苯）中進行脫蠟處理3次，每次10 min，確保脫蠟干凈后進行梯度水化，梯度水化為無水乙醇→95%乙醇→90%乙醇，每個梯度水化5 min.1.3.3抗原修復

1.3.3.1 水煮修復法

取2 000 mL修復液于不銹鋼鍋中，置于電磁爐上加熱至沸騰后，放入組織片進行修復，修復時間分別為10 min和20 min.

1.3.3.2 微波修復法

將組織切片放入2 000 mL修復液中置于微波爐中，微波爐高火（功率750 W）加熱至沸騰后，調至中火（功率375 W）開始修復，修復時間分別為10 min和20 min，修復后用自來水迅速降至室溫.

1.3.3.3 高壓修復法

將組織切片完全浸置于修復液中，放入高壓鍋內0.1 MPa（121℃）分別進行修復2 min、2.5 min、3 min和5 min，修復完后，迅速降壓降溫至常溫常壓后進行清洗.

1.3.4 阻斷（內源性過氧化物酶的滅活）

立即將修復完后的組織切片進行多次水洗后，置于過氧化物酶封閉液中阻斷10min，再進行水洗，然后置于PBS溶液中.

1.3.5 抗體孵育

從PBS溶液中取出組織切片，迅速甩干大量水珠，放于免疫組化濕盒中，快速滴加即用型一抗，23℃孵育30 min后，用PBS溶液沖洗后，置于PBS溶液清洗缸中取出組織切片去掉大部分水份滴加二抗，室溫孵育20 min，再用PBS沖洗后浸泡.

1.3.6 DAB顯色與蘇木素復染

從PBS溶液中取出組織切片，甩干大量水分后，迅速滴加DAB顯色液，顯色3 min后，吸干大部分顯色液后，置于DAB清洗液中多次水洗，然后用Mayer’s蘇木素溶液進行復染30 s.

1.3.7 PBS返藍

將組織切片放進PBS溶液中進行返藍1 min，返藍后的蘇木素是標記出細胞核的位置，方便觀察時做目標區域的參照物，返藍后多次水洗.

1.3.8 脫水、透明、封片和鏡檢

將片子放進95%乙醇脫水1min后，分別用無水乙醇脫水2次，每次1 min；將切片架放于環保透明脫蠟劑中脫蠟2次，每次3 min，用中性樹膠滴入封片后，標記歸類；利用Leica ICC50 HD Camera進行拍照保存，并對染色結果進行評分.

1.4 評分標準

判斷評分標準參考文獻［6］的方法進行評分.評分方法1：在判斷中只考慮陽性細胞所占的百分比，按不同的百分比分級；將陽性細胞百分比分成5級，無陽性細胞為0分，陽性細胞≦25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分.評分方法2：在判斷中只考慮陽性細胞的染色程度，按不同的染色強度分級；著色強度無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分［6］.試驗中，Ki67 采用方法 1 的評分方法；CK5/6、CK7、P53和P63采用方法2的評分方法.

圖1 CK5/6的3種修復方法比較結果圖

圖2 CK7的3種修復方法比較結果圖

2 結果與分析

對5種抗體的3種修復方式，結果分別見圖1-5，評分結果見表2.由圖1-5和表2可知：5種抗體高壓修復的效果均為強表達；微波20 min修復P53和P63均為強表達.CK5/6、CK7和ki67在高壓修復較其它兩種修復方式有更為理想的染色效果；從節省時間，降低掉片概率及出現背景概率等方面綜合考慮，故將Tris-EDTA(pH9.0)高壓修復2 min作為最佳修復方式.而P53及P63的微波修復20 min染色強度與高壓修復的結果一致，均為強陽性.5種抗體的水煮修復法的染色效果均不理想，主要由于修復液的大量蒸發不但浪費試劑還有可能影響修復液濃度從而導致修復效果不穩定，故不宜使用該方法.微波修復20 min對于部分組織的修復效果可以達到要求，但是微波修復也存在不足，如：長時間的浸泡和機械力容易導致掉片；修復液的大量蒸發浪費試劑，嚴重時導致干片，抗原失活.綜上所述，較佳的修復方式為高壓修復2 min.

圖3 ki67的3種修復方法比較結果圖

圖4 P53的3種修復方法比較結果圖

3 討論

免疫組織化學的染色質量受整個試驗過程多方面因素的影響，如溫度、抗原修復方法、抗體濃度、孵育時間及顯色時間等多種因素.抗原修復方法是關鍵的因素之一.由于采用不同的抗原修復方法，導致免疫組化實驗結果差異極大甚至出現假陰性.因此尋找理想的抗原修復方式可提高抗原檢出率，提高免疫組化結果的準確性［7］.

圖5 P63的3種修復方法比較結果圖

表1 3種抗原修復法對免疫組化染色結果的比較

本研究僅對5種抗體采用了3種修復方式的研究，有待一步探究其它的修復方式，以期獲得更為直觀和方便可行的修復方法.

［1］姚梅宏,鄭智勇.免疫組化抗原修復技術新進展[J].臨床與實驗病理學雜志,2013,29(5):544-547.

［2］陳余朋,張聲,王行富,等.不同的抗原修復方法在Ⅳ型膠原免疫組化染色中的應用[J].臨床與實驗病理學雜志,2014,30(1):98-100.

［3］宿穎,劉曼,張辛燕.不同抗原修復方法對KLF4在小鼠舌黏膜上皮中表達的比較[J].北京口腔醫學，2014,14(6):344-346.

［4］Jagirdar J.Immunohistochemistry:then and now[J].Arch Pathol Lab Med,2008,132(3):323-5.

［5］Shi S R,Taylor C R.Extended application of antigen retrieval technique in immunohistochemistry and in situ hybridization[A].Shi S R，Taylor C R，eds.Antigen retrieval immunohistochemistry based research and diagnostics[C].Hoboken:John Wiley,2010:25-45．

［6］許良中，楊文淘.免疫組織化學反應結果的判斷標準[J].中國癌癥雜志,1996,6(4):229-231.

［7］何新明,顧霞,郭文婷,等.免疫組織化學染色存在的問題及解決方案[J].實用醫技雜志,2017,24(8):871-872.