自由基引發劑對環糊精整體柱手性分離能力的影響研究

郭嘉亮，汪錦才 ，鄧秋瑩 ，歐陽永中 ，嚴 文，李艷萍，黃文柱

（1.佛山科學技術學院醫藥工程學院，廣東 佛山 528000； 2.廣東藥科大學，廣東 廣州 510006；3.廣東省佛山市第五人民醫院，廣東 佛山 528000）

整體材料（monolith）由于具有通透性強、傳質快、反壓低、易于制備與修飾等優勢，被廣泛應用于多個分離科學領域[1]，被譽為“第4代色譜分離介質”。隨著固載方法的進步，將重要的手性拆分劑環糊精（β－cyclodextrin，β－CD）固定于石英毛細管整體柱上制備而成的“環糊精整體柱”，因可避免制塞的難題而得到快速發展，尤其在手性藥物的分離分析領域有舉足輕重的地位，并在富集、固相萃取等方面發揮著越來越重要的作用[2－4]。

近年來，β－環糊精整體柱的制備研究成了相關研究領域的重點與熱點[5]。本課題組一直致力于環糊精有機聚合物整體柱的制備工藝研究[5－7]，對包括交聯劑、致孔劑、間隔臂、制備策略在內的多種因素對其手性分離能力的影響進行了一系列探討。現有的環糊精有機聚合物整體柱，如丙烯酸酯類（acrylates）、丙烯酰胺類（acrylamides）和苯乙烯類（styrenes）等[2]，一般通過“原位”（in situ）自由基聚合方式實現，故自由基引發劑（radical initiator）作為單體進行聚合反應的起源，對整體材料的聚合情況產生重要作用，對其色譜學性能也有不可忽視的影響。當前制備β－環糊精的甲基丙烯酸酯類整體柱采用的引發劑主要為偶氮類引發劑偶氮二異丁腈（azobisisobutyronitrile，AIBN）[6－8]。它有油溶性，其—N＝N—雙鍵易于分裂并生成高活化能的自由基；同時，反應穩定，屬一級反應，只產生一種自由基，無其他副反應產生，因此易控制且基本不發生誘導分解。然而，由于水溶性不佳，AIBN在制備整體柱時，難以用于強溶劑極性的聚合體系。據了解，另一種水溶性的偶氮引發劑偶氮類引發劑2，2′－偶氮二異丁腈脒二鹽酸鹽[2，2′－Azobis（2－methylpropionamide)dihydrochloride，AIBA]可克服 AIBN水溶性差等缺點，但目前仍未見AIBA用于環糊精有機聚合物整體柱的制備研究。

因此，本研究中首次采用AIBN和AIBA 2種性質不同的自由基引發劑，以單－6－乙二胺基－β－環糊精（6－EDA－β－CD）為手性選擇劑，分別制備獲得了2款不同的 100 μm內徑毛細管整體柱 poly（GMAEDA －β －CD －co－MBA）（Column A 和 Column B），并進行系統對比，以分析不同引發劑對環糊精整體柱各種性能（尤其是手性分離能力）的影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Vario EL元素分析儀（德國Elementar公司）；Merlin高分辨場發射掃描電子顯微鏡（德國Zeiss公司）；DSC 214差示掃描量熱儀（德國Netzsch公司）；DiNa－S納流泵（日本KYA公司）；100 μm內徑彈性熔融石英毛細管（河北銳灃色譜器件公司）。

1.2 主要試劑

N，N′－亞 甲 基 雙 丙 烯 酰 胺 （N，N′－methylene bisacrylamide，MBA）、甲基丙烯酸縮水甘油酯（Glycidyl methacrylate，GMA）、AIBN、AIBA、4－氯－扁桃酸、2－溴－扁桃酸、2－（3－氯苯氧基）丙酸、2－苯氧基丙酸、布洛芬、舒洛芬均購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；單－6－乙二胺基 －β－環糊精（6－EDA－β－CD）購自山東濱州智源生物科技有限公司。

2 方法和結果

2.1 毛細管整體柱的制備

毛細管預處理：參考文獻[9]，以1 mol／L的氫氧化鈉、去離子水、甲醇（MeOH）、γ－甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷（γ－MAPS）和MeOH的混合液先后沖洗石英毛細管，得預處理好的毛細管空管，氮氣吹干，待用。

整體柱制備：參考文獻[7，10]所報道的混合物配比，分別將適量的單體化合物 6－EDA－β－CD和GMA，助溶劑二甲基亞砜（DMSO），致孔劑MeOH混合，加熱至60℃反應30 min；加入交聯劑MBA和引發劑（AIBN或AIBA）；灌入預處理好的毛細管空管中，封閉，繼續加熱進行自由基聚合反應；最后，用MeOH沖洗掉毛細管內部未反應物、殘留溶劑、低聚雜質等，得到相關的整體柱 Column A（AIBN引發）與 Column B（AIBA引發）整體柱（制備過程見圖1）。同時，考察各個節點的反應溫度和時間變化的影響。

2.2 引發條件的優化

圖1 Column A和Column B制備過程

環糊精整體柱的優化方法參考本課題組的前期工作[6－7]。對引發劑使用量的研究結果顯示，引發劑用量增多，反應加快，即無論是AIBN還是AIBA，成核與核聚結速率均明顯變快，且用量為單體質量的2%時效果最佳。此外，還重點考察了引發溫度和引發時間的影響，優化方案見表1。AIBA所引發的原位聚合反應，溫度和時間對引發效果的影響非常明顯。如以溫度為55℃為例，反應時間為6～24 h，整體柱聚合不佳，過于疏松（too slack），說明 55℃下 AIBA無法充分引發聚合反應；當溫度升至60℃時，整體柱聚合情況大為改善；當反應時間為6 h時，內部聚合最均勻，通透性良好，內部孔道相互貫通，形成一個網狀結構，但24 h后則變得太緊（too hard），結構過于嚴密，無法形成有效的傳質；升溫至65℃后，制備得到的整體柱聚合物均呈凝膠狀態（gel），背壓（backpressure）非常高。故選擇反應溫度為60℃，反應時間為6 h作為引發劑AIBA的引發條件，較之引發劑AIBN引發速率更快，聚合時間需要更短（Column B 為 6 h，而 Column A 為 12 h）。

表1 Column A和Column B引發溫度與時間優化表

2.3 整體柱的化學表征

2.3.1 差示掃描量熱分析

[5]的具體操作，通過差示掃描量熱（DSC）分析來測定整體柱聚合物材料的熱穩定性，初步推斷β－環糊精是否成功鍵合在整體柱骨架材料上。差示掃描量熱分析結果顯示，整體材料具有良好的熱穩定性，310℃處有明顯的吸熱峰，分析為β－環糊精的熱分解峰[5]，可大致判斷β－環糊精成功鍵合在交聯聚合物上。

2.3.2 元素分析

通過元素分析的結果考察，采用不同引發劑制備得到的Column A與Column B整體柱的組成。結果見表2。可見，Column A與Column B中6－EDA－β－CD的含量基本一致，Column B中環糊精含量略高。

表2 Column A和Column B的元素分析測定結果

2.4 整體柱的物理表征[6－7]

2.4.1 通透性和重復性

整體柱的通透性數據是衡量其性能的重要依據之一。以不同流動相[乙腈、甲醇、乙腈－水（等體積）]作比對，并根據 Darcy方程公式計算而得[6]。以乙腈為例，Column A和 Column B的通透性分別為 6.70×10－14m2和 3.10×10－14m2；以甲醇為例，Column A 和 Column B的通透性分別為 6.40 ×10－14m2和 2.37 ×10－14m2；以乙腈－水為例，Column A和Column B的通透性分別為4.80 ×10－14m2和 1.96 ×10－14m2。上述結果表明，兩者均具有較好的通透性（同一數量級），并未隨流動相的改變而發生顯著的形變或溶脹。這也從側面反映了柱子具有穩定性良好的骨架結構。

此外，以乙腈 －水（50∶50，V∶V）為流動相，甲苯和硫脲作為測試化合物，測定Column A與Column B的范迪姆特方程曲線（圖 2）。Column B在最佳線性流速（0.381 mm ／s）下其理論板高為 26.03 μm，曲線斜率較大，呈“斜坡狀”，說明其在高流速下理論板數較低；Column A在最佳線性流速（0.424 mm／s）下的理論高度為21.49 μm，曲線斜率較小，這說明其在較高的流速下仍能保持較理想的理論板數，更有利于快速分離。可見，Column A比Column B更適宜快速分離分析。此外，還對Column A和 Column B的重復性，包括 day－to－day（n＝3）、 batch－to－batch（n＝5）、 column－to－column（n＝10）進行了考察。結果相對標準偏差（RSD值）均在5%以下，表明方法重復性良好，且嘗試連續進針30 d以后，未出現較大誤差。

圖2 Column A和Column B的范迪姆特方程曲線

2.4.2 掃描電鏡分析

對比Column A和Column B毛細管橫截面的掃描電鏡情況，見圖3。發現兩者孔狀分布較均勻，不同部位的基本型貌非常相似：不規則的球形結構堆積成其基本骨架，并形成典型的網狀外觀；同時與石英毛細管內壁結合緊密，整體聚合情況良好。但觀察其微觀形貌可發現聚合物形態仍有差異。Column A的聚合物在孔徑和粒徑分布上顯然更均勻而明顯；Column B的聚合物粒徑內部結構相較Column A稍顯疏松，聚合物顆粒黏連在一起，成核形態也不如Column A顯著。結果表明，引發劑對整體柱的整體骨架無明顯作用，但對其內部聚合情況有顯著影響。骨架結構改變可減小傳質阻力，降低整體柱背壓，但具體形貌對高流速下的快速分析和分離效果更重要。

圖3 Column A和Column B掃描電鏡圖

2.5 整體柱的色譜性能表征

2.5.1 保留機制研究

通過對比極性化合物保留機理的變化，有助于判斷整體柱色譜性能。本研究中采用甲苯（非極性標志物）和硫脲（極性化合物）作為測試標準，乙腈和水為流動相，通過改變流動相中有機相與水相比例，考察Column A與Column B的極性保留因子（k）的變化。當乙腈含量從60%降低至30%時，甲苯的保留因子（k）顯著增加，硫脲的保留因子基本不變；當乙腈含量從60%升高至90%時，甲苯的保留因子基本不變，硫脲的保留時間有所增長，可見，Column B與Column A整體柱的保留機理一致。研究結果證明，引發劑并未對整體柱骨架的極性及保留機理產生影響。

2.5.2 手性選擇性評估

本研究中參考文獻[7，10]的方法配制緩沖鹽溶液，以4－氯－扁桃酸、2－溴－扁桃酸、2－（3－氯苯氧基）丙酸、2－苯氧基丙酸、布洛芬、舒洛芬6種手性藥物及中間體作為評估對象，對Column A和Column B的手性拆分能力進行評估，考察引發劑對β－環糊精整體柱手性分離能力的影響。結果Column A和Column B對上述手性化合物基本實現基線分離，且分離時間較短（4～8 min），完全體現了整體柱在快速分離上的優勢。Column A的手性分離效果明顯優于Column B（表3）。以4－氯－扁桃酸為例，在分離條件一致的情況下，其在Column A和Column B整體柱上的分離度 Rs分別為5.03和 3.17，對應的分離因子 α分別為 1.90和 1.80。綜合比較，Column A和Column B對幾種酸性手性化合物的分離效果均較理想，但對堿性手性化合物卻基本無法實現基線分離。

手性拆分能力為評價環糊精整體柱關鍵標準之一，Column A整體柱該能力優于Column B。可見，引發劑的性質同樣能對整體柱的柱性能和手性分離能力造成影響，分解反應較平穩的脂溶性引發劑AIBN可能更適合β－環糊精有機聚合物整體柱的制備。分析其原因，應該是由于引發劑AIBN引發所形成的整體材料（ColumnA）雖然環糊精含量較低，但由于聚合反應的差異，材料表面上所暴露的有效環糊精卻高于AIBA引發所形成的整體材料（Column B）。Column B盡管環糊精含量高，但可能由于包埋作用，實質上可用于手性分離的有效環糊精含量卻不如Column A。

表3 6種手性化合物在Column A和Column B上的手性分離效果

3 討論

近年來，引發劑對整體柱色譜性能的影響已有大量報道[11－13]，并成為了有機整體柱研究領域的熱點。然而，在手性整體柱研究領域，相關研究尚處于空白階段。大分子手性配體如環糊精、奎尼丁、萬古霉素等由于自身的理化性質，在整體材料固定化過程中，需考察大量制備因素，而自由基引發劑的選擇將發揮重要作用。

本研究中創新性地取代常用的油溶性引發劑AIBN，以水溶性引發劑AIBA通過一鍋法成功制備了整體柱Column B，并系統考察了引發劑用量、引發溫度和引發時間等重要因素；通過表征整體柱的化學性質（差示掃描量熱分析和元素分析）、物理性質（通透性、重復性和掃描電鏡）以及色譜性能（保留機制和手性拆分評估），對Column A與Column B進行了全面對比。研究表明，2種引發劑的使用量為單體質量的2%時，效果最佳，且引發條件差異不大。Column B所需制備時間及鍵合環糊精的量也比較高；同時，其聚合物粒徑內部結構較疏松，相對而言不如Column A理想。在關鍵的手性拆分效果上看，以AIBN為引發劑制備得到的Column A的實際分離效果明顯優于以AIBA為引發劑制備得到的Column B。

綜合兩款整體柱的一系列對比結果進行判斷，引發劑AIBA屬水溶性偶氮類引發劑，在該致孔劑條件下，聚合速度快，反應條件更溫和；但在水溶液聚合與乳液聚合過程中，對于有機聚合物的引發效果不佳，難以進行平和、穩定、可控制的分解反應，導致Column B整體柱內部的聚合物粒徑較小，孔徑分布不均勻。AIBN雖然水溶性較差，但在DMSO的助溶作用下，仍可達到相應的聚合效果。

本研究結果提示，引發劑對β－環糊精整體柱的手性分離能力有一定影響，選用水溶性引發劑雖可大幅縮短反應時間，但并不能改善β－環糊精整體柱的手性分離能力，脂溶性AIBN引發劑盡管反應時間稍長，但更適用于β－環糊精有機聚合物整體柱的制備。本研究為手性單體尤其是大極性手性單體的整體材料引發系統研究提供了科學的參考依據。后續研究將從具有相轉移能力的引發劑著手，以期獲得更加理想的引發系統。

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