高效液相色譜－二極管陣列檢測器法測定食用土當歸總有機酸中貝殼杉烯酸及海松酸含量

黨凱茹 ，彭 騰 ，楊 菁 ，禹亞杰 ，匡 宇 ，韓 笑

（1.成都中醫藥大學藥學院·中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地·中藥材標準化教育部重點實驗室，四川 成都 611137； 2.貴陽中醫學院，貴州 貴陽 550002； 3.四川護理職業學院，四川 成都 611137）

食用土當歸 Aralia cordata Thunb.是五加科 木屬植物的根及根莖，是商品九眼獨活的主流品種，其作藥用最早收載于《本草綱目》[1]，味辛、苦，性微溫，具有祛風除濕、止痛利尿消腫的功效[2]。該藥為多年生草本，主產區為四川，阿壩、涼山、甘孜等州產量最大，陜西、湖北等地亦有分布，為藥食兩用的傳統中藥[3]。食用土當歸總有機酸是從食用土當歸的根及根莖中提取純化得到的提取物，課題組前期藥理試驗研究表明，該總有機酸為食用土當歸抗炎鎮痛的有效成分[4]。總有機酸所含主要化學成分是貝殼杉烯酸、海松酸等二萜羧酸類，貝殼杉烯酸及海松酸為抗炎鎮痛的有效成分[5－6]。目前對食用土當歸的研究較少，僅限于對其化學成分及藥理活性的研究，對食用土當歸總有機酸的報道主要針對于其提取純化工藝和抗炎鎮痛藥效學方面，質量控制方面的研究未見報道；此外，2015年版《中國藥典(一部)》未收載該藥，而2010年版《四川中藥材標準》也缺乏詳細而深入的研究，該藥的質量標準基本還處于空白狀態。故本試驗中通過建立測定貝殼杉烯酸和海松酸含量的高效液相色譜－二極管陣列檢測器（HPLC－DAD）法，為食用土當歸總有機酸的質量控制提供參考，也為食用土當歸藥材標準的建立奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－20AT型 HPLC儀，SPD－M20A型 DAD檢測器（日本島津公司）；BUG25－12型超聲清洗器（必能信超聲有限公司）；色譜柱為 YMC－Pack ODS－AQ柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；FA2004N 型電子天平（上海民怡儀器儀表有限公司）；BP121S型電子天平（德國Sartorius公司）；DZG－6020型真空干燥箱（上海信森實驗儀器有限公司）；DZKW－4型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司）。

1.2 試藥

乙腈、甲醇均為色譜純（美國天地公司）；磷酸為分析純（成都科龍化工試劑廠）；優普UPT系列超純水（成都優普電子產品有限公司）；其他試劑均為分析純。

貝殼杉烯酸對照品、海松酸對照品（均為實驗室自制，HPLC儀檢測純度超過98%）；食用土當歸 Aralia cordata Thunb.藥材購自四川省成都市荷花池中藥材市場，經成都中醫藥大學藥學院蔣桂華教授鑒定為五加科

木屬植物食用土當歸 Aralia cordata Thunb.的根及根莖；食用土當歸總有機酸（10批自制食用土當歸藥材樣品，批號分別為 201301，201302，201303，…，201310，棕褐色稠膏狀）。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

混合對照品溶液：稱取干燥至恒重的貝殼杉烯酸及海松酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL分別含 225.7 μg 和 283.9 μg 的混合對照品溶液。

食用土當歸總有機酸[7]：取食用土當歸粉末，加8倍量95%乙醇回流提取2次，每次1 h，抽濾，合并濾液，減壓濃縮干燥，得食用土當歸乙醇提取物，乙醇提取物20倍量水溶解后，加NaCl使質量分數達0.50%，2倍量石油醚萃取4次，萃取液濃縮至乙醇提取物20倍量體積，再用1.0%KOH溶液等體積萃取3次，堿水層加濃鹽酸使 pH達1，加 NaCl使質量分數達0.50%，用等體積石油醚萃取3次，減壓回收石油醚，干燥，即得。

供試品溶液：取食用土當歸總有機酸約25 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度，搖勻，即得。

2.2 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：YMC－PackODS－AQ柱（250mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 － 0.1% 磷酸水溶液（76 ∶24）；檢測波長：202 nm；流速：1.0 mL ／min；柱溫：30 ℃；進樣量：15 μL。在上述色譜條件下分別取混合對照品溶液、供試品溶液自動進樣，記錄色譜圖（見圖1）。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 耐用性考察

色譜柱考察：按2.2項下色譜條件，考察了Phenomenex Luna C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），Agilent Eclipse plus C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），YMC －Pack ODS－AQ 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）3 種色譜柱對供試品中貝殼杉烯酸及海松酸的影響，結果見表1。可見，3種色譜柱均可用于食用土當歸總有機酸的貝殼杉烯酸和海松酸的含量測定。

表1 色譜柱考察結果

流速考察：按 2.2項下色譜條件，以 YMC－Pack ODS－AQ 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，考察不同流速對供試品溶液中貝殼杉烯酸及海松酸含量的影響，結果見表 2。可見，流速在 0.8～1.2 mL ／min 時，測得含量的 RSD值小于3%，分離度也好，均可作為食用土當歸總有機酸中貝殼杉烯酸和海松酸的含量測定用流速。

表2 流速考察結果

柱溫考察：按2.2項下色譜條件，考察不同柱溫對供試品溶液中貝殼杉烯酸及海松酸含量的影響，結果見表3。可見，柱溫在25～35℃之間時，RSD值均在3%以內，分離度也好，均可作為食用土當歸總有機酸中貝殼杉烯酸和海松酸的含量測定用柱溫。

表3 柱溫考察結果

2.4 方法學考察

線性關系考察：取混合對照品溶液自動進樣，分別進樣 10，12，14，16，18，20 μL，以進樣量(X)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標分別繪制標準曲線，得貝殼杉烯酸回歸方程為 Y＝1.6×106X ＋25 642（R2＝0.999 6，n＝6），海松酸 回 歸方程 為 Y＝1.6×106X－20 531（R2＝0.999 6，n＝6）。結果表明，貝殼杉烯酸對照品溶液進樣量在 2.257 ～ 4.514 μg，海松酸對照品溶液進樣量在2.839～5.678 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：按2.2項下色譜條件，精密吸取混合對照品溶液15 μL，連續進樣6次。結果貝殼杉烯酸和海松酸峰面積的 RSD分別為0.27%和0.25%(n＝6)，均小于3%，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液，于配制后0，4，8，12，16，24 h 時進樣 15 μL，測定貝殼杉烯酸和海松酸峰面積。結果的 RSD分別為 0.27%和 0.32%(n＝6)，均小于3%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

重復性試驗：稱取食用土當歸總有機酸（批號為201307）6份，每份約25 mg，精密稱定，依法制備供試品溶液，以 2.2項下色譜條件進樣 15 μL，測定。結果貝殼杉烯酸和海松酸平均含量分別為19.20%和27.43%，RSD 分別為 2.24% 和 1.34%(n＝6)，均小于 3% ，表明該方法重復性良好。

加樣回收試驗：稱取已知含量的同一批（批號為201307）食用土當歸總有機酸6份，約12.5 mg，精密稱定，分別精密加入一定量混合對照品溶液，依法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件進樣15 μL。結果見表4。

表4 貝殼杉烯酸與海松酸加樣回收試驗結果(n＝6)

2.5 樣品含量測定

分別稱取不同批號的食用土當歸總有機酸，依法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件進樣 15 μL，測定樣品中貝殼杉烯酸和海松酸的峰面積，按外標一點法計算，結果見表5。

表5 樣品中貝殼杉烯酸和海松酸的含量測定結果（%，n＝10)

3 討論

食用土當歸總有機酸中貝殼杉烯酸和海松酸的總平均含量為46.87%，表明提取純化后的總有機酸中仍可能含有脂肪酸等其他小分子酸。課題組今后可對其純化研究工藝進行進一步優化，以期得到含量更高的總有機酸，完善以貝殼杉烯酸和海松酸為指標的食用土當歸總有機酸的質量標準，同時結合生產，實施工藝放大驗證，為食用土當歸總有機酸的工業化生產提供依據。海松酸和貝殼杉烯酸均有抗炎鎮痛活性，且海松酸平均含量比貝殼杉烯平均含量高8.41%，由此可設想從2個單體成分在總有機酸中含量不同的角度，對各自的抗炎鎮痛活性程度進行對比研究。

本課題組前期采用正交試驗法對食用土當歸中總有機酸的提取工藝參數進行優選，同時采用有機溶劑萃取法與酸堿法相結合的方法，通過單因素試驗，從檢測器和流動相選擇上對總有機酸的純化工藝進行了優選。檢測器比較發現，蒸發光散射檢測器（ELSD）所得的圖譜中只出現貝殼杉烯酸和海松酸2個峰，無法辨別是否已與其他雜質峰分開；此外，ELSD檢測器的準確度和重復性相對較差，故選擇DAD檢測器進行檢測，并參考文獻[8]對乙腈 －水（76 ∶24）、乙腈 －0.1%磷酸水（76∶24）、乙腈－0.2%磷酸水（76∶24）3種流動相進行了考察，結果表明，3種流動相均能達到較好分離，但與未加磷酸相比，加了磷酸后所得色譜圖的峰形更好，且考慮到色譜柱的使用壽命，故選擇酸度較低的乙腈－0.1%磷酸水溶液（76∶24）作為流動相。

[1]王忠壯，蘇中武，李承枯，等.中藥獨活、九眼獨活及羌活的本草考證和資源調查[J].中國中藥雜志，1995，20（9）：515 － 517.

[2]包柏林.中藥九眼獨活的研究[J].藥學實踐雜志，1998，16（1）：34 － 38.

[3]王忠壯，蘇中武，李承祜.中藥九眼獨活的商品調查及生藥鑒定[J].中國中藥雜志，1994，19（12）：707 － 709.

[4]楊 菁，彭 騰，禹亞杰.食用土當歸總有機酸的抗炎鎮痛作用[J].中成藥，2016，38（10）：2117 － 2121.

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[7]楊 菁，彭 騰，凌智群，等.食用土當歸中總有機酸的純化工藝優選[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（8）：17 － 19.

[8]歐惠英，李廷昊，樂美麟，等.食用土當歸中齊墩果酸含量分析[J].江蘇林業科技，1995，22（2）：35 －36.