金蓮花膠囊高效液相色譜指紋圖譜研究

李勇軍 ，蔣 禮 ，2，何燕玲 ，2，劉春花 ，陸 苑 ，沈國華 ，許祖超 ，劉 亭

（1.貴州醫(yī)科大學民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心·國家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽550004； 2.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫(yī)科大學貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州貴陽 550004； 4.貴州益康制藥有限公司，貴州 貴陽 550025）

金蓮花為毛茛科金蓮花 Trollius chinensis Bge.的干燥花蕾，味苦，性寒，有抗炎、抑菌作用，可用于上呼吸道感染，咽炎，扁桃體炎等的治療[1－3]。金蓮花膠囊是金蓮花的干燥花及花蕾制成的單方制劑，能清熱解毒、利咽消腫，臨床常用于上呼吸道感染，如扁桃體炎、咽炎等的治療[4－5]。近年來的研究表明，金蓮花膠囊的主要有效成分為總黃酮，其中葒草苷、牡荊苷和槲皮素含量最高[6]。季日麗等[7]采用高效液相色譜（HPLC）法對金蓮花膠囊中3種黃酮苷含量進行測定，制訂了該膠囊的定量方法。譚安菊等[8]發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地的金蓮花藥材成分含量存在一定差異。故僅針對中成藥的某個有效成分或指標成分進行定性、定量分析，并不能全面有效地控制其質(zhì)量，通過紅外光譜、HPLC法等建立指紋圖譜，全面控制產(chǎn)品質(zhì)量是發(fā)展趨勢[9]。為了更好地控制金蓮花膠囊產(chǎn)品質(zhì)量，本研究中采用HPLC法建立金蓮花膠囊的指紋圖譜，為該制劑的質(zhì)量控制提供更加科學有效的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Prominenece UFLC型液相色譜儀系統(tǒng) （日本島津公司，包括2臺LC－20AD型二元梯度泵、DGU－20A3型在線真空脫氣機、SIL－20AHT型自動進樣器、CTO－10Asvp型柱溫箱、SPD－20A型紫外檢測器、LC－Solution色譜工作站）；AE240型十萬分之一電子天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司）；CQ－250A－ST型超聲波清洗器（上海躍進醫(yī)用光學器械廠）；超純水機（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試藥

對羥基苯甲蘋果酸、葒草素 －2－O′′－β－ L－半乳糖、葒草素、牡荊素均由貴州醫(yī)科大學貴州省藥物制劑重點實驗室制備，經(jīng) MS，1H－MNR，13C－NMR結(jié)構(gòu)確證，經(jīng)HPLC在多個波長檢測，其峰面積歸一化含量均大于98%；金蓮花膠囊17批（批號依次為20081002，20061201， 20061203，20070101， 20070103，20070104，20070105， 20070106， 20070201， 20070203， 20070301，20090802， 20091106， 20110217， 20100901， 20101201，20100310，編號為 S1～S17），其中 S1～S13由貴州益康制藥有限公司提供，S14～S17分別由A藥業(yè)公司、牙克石市森健藥業(yè)有限公司、吉林天藥本草堂制藥有限公司、B藥業(yè)公司提供；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Gemini5uC18110A柱（250mm×4.6 mm，5 μm ）；流動相：乙腈 － 0.1% 磷酸水溶液，梯度洗脫（0～17 min，7% ～19%乙腈；17～35 min，19% ～22%乙腈；35 ～55 min，22% ～50% 乙腈）；流速：1.0 mL ／min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：230 nm；記錄時間：55 min。

2.2 溶液制備

對照品溶液：分別精密稱取對羥基苯甲蘋果酸、葒草素－2－O′′－β－L－半乳糖、葒草素、牡荊素適量，用甲醇溶解，配置成質(zhì)量濃度為 7.50，16.65，14.70，2.83 μg ／mL 的混合對照品溶液，備用。

供試品溶液：取金蓮花膠囊內(nèi)容物0.2 g，精密稱定，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，上清液用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學考察

精密度試驗：分別取同一批供試品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，結(jié)果的 RSD介于0.8% ～1.9%。采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004年A版）”進行相似度計算，以第1次進樣所得色譜圖為參照，其余5次進樣所得色譜圖與之比較，結(jié)果相似度均大于0.99，表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批供試品溶液6份，測定其指紋圖譜，采用同一系統(tǒng)進行相似度計算，以第1次進樣所得色譜圖為參照，其余5次進樣所得色譜圖與之比較，結(jié)果相似度均大于0.99，表明指紋圖譜重復性良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h時進樣，測定各指標成分峰面積。采用同一系統(tǒng)進行相似度計算，以第1次進樣所得色譜圖為參照，其余5次進樣所得色譜圖與之比較，結(jié)果相似度均大于0.99，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜的建立及相似度計算

圖1 17批金蓮花膠囊樣品指紋圖譜

指紋圖譜的建立：取17個批次的金蓮花膠囊，按2.2項下方法平行制備供試品溶液17份，按2.1項下色譜條件進行測定，并將結(jié)果導入前述評價系統(tǒng)進行色譜峰匹配，生成對照圖譜，并對17批次金蓮花膠囊樣品進行相似度計算。結(jié)果見圖1和表1。

表1 17批金蓮花膠囊相似度比較結(jié)果

主要色譜峰的指認：選擇17批次金蓮花膠囊樣品中共有色譜峰作為指紋圖譜的共有峰，有23個共有峰，通過對照品和高效液相色譜－二極管陣列檢測器－質(zhì)譜（HPLC－PDA－MS）歸屬了4個色譜峰，詳見圖2。

圖2 金蓮花膠囊指紋圖譜及混合對照品圖

指紋圖譜相似度評價：由表1可見，貴州益康制藥有限公司生產(chǎn)的13批次金蓮花膠囊與對照指紋圖譜相似度均大于0.87，較穩(wěn)定；而4批非益康制藥公司生產(chǎn)的制劑指紋圖譜與共有模式比較，除S15和S16的相似度為0.88和0.79外，S14和S17與益康制藥公司金蓮花膠囊的共有模式比較，相似度為0.48和0.50，說明不同廠家生產(chǎn)的金蓮花膠囊差異較大。

3 討論

本試驗中分別以甲醇、乙醇及70%，50%，30%甲醇為溶劑，超聲提取，測定，以色譜中峰的信息量、制劑中各色譜峰的單位質(zhì)量峰面積及對照品含量為指標，考察不同溶劑的提取效果，指紋圖譜及測定結(jié)果表明，甲醇超聲提取效果較好，且不同濃度的甲醇提取對指紋圖譜中各共有峰的提取率有一定差異。經(jīng)比較，最終采用70%甲醇為提取溶劑。

本試驗中利用PDA檢測器在190～400 nm波長進行全波長掃描，并對各波長下的色譜圖進行分析、比較。結(jié)果表明，金蓮花膠囊的指紋圖譜在230 nm波長處檢測時，較其他波長檢測的信息量大，能兼顧各成分色譜峰的豐度、分離度和基線，而4個對照品在230 nm波長處均有吸收，有較高的靈敏度，故選擇230 nm作為檢測波長。

本研究中首次建立了金蓮花膠囊的HPLC指紋圖譜，共標定了23個共有指紋峰，指認了4個色譜峰。采用相似度分析對不同批次金蓮花膠囊指紋圖譜進行評價，發(fā)現(xiàn)不同廠家樣品的質(zhì)量存在一定差異，其中2批相似度較低樣品（S14，S17）的指紋圖譜中出現(xiàn)其他15批制劑指紋圖譜中沒有的較大的峰，經(jīng)質(zhì)譜分析為蘆丁，疑為在金蓮花膠囊添加了蘆丁。金蓮花膠囊現(xiàn)行標準比較簡單，難以保證其質(zhì)量的穩(wěn)定，而指紋圖譜能更全面地表征藥品信息，并反映其一致性和穩(wěn)定性，可為提升金蓮花膠囊的質(zhì)量標準提供參考。

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