響應面法優(yōu)化蒙藥肋柱花總皂苷超聲提取工藝

李紅嬌，劉 婷，孫興姣，樊 培，李 驍

（內蒙古醫(yī)科大學藥學院，內蒙古 呼和浩特 010110）

肋柱花（蒙藥名哈畢日干－地格達）生長于海拔4 200 m以下的山坡、草地及水溝邊，為龍膽科植物肋柱花 Lomatogonium rotatum（L.） Fries ex Nym 的干燥全草，分布于西南、西北、華北、東北等地區(qū)[1]，主治肝膽熱、黃疸、傷寒、流感、中暑頭痛、瘟疫等病癥[2－3]。其常作為主藥與胡黃連、梔子、瞿麥配伍為地格達－4味湯散，用于治療血熱證，又可與查干泵嘎、木鱉子（制）、木香等配伍為八味地格達湯，用于治療協日性頭痛、中暑、身目發(fā)黃、肝熱證[4]。研究發(fā)現，肋柱花中含有黃酮類及其苷類、環(huán)烯醚萜類、三萜類及其苷類、內酯類、有機酸及酚類化合物[5－7]。其中三萜類及其苷類化合物具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、免疫調節(jié)等活性[8－9]。目前，超聲波輔助提取法已得到廣泛應用，尤其是在提取工藝優(yōu)化方面已逐漸成為一種新方法。為此，本試驗中選取乙醇體積分數、液料比、超聲時間3個因素，通過響應曲面法優(yōu)選蒙藥肋柱花總皂苷提取工藝，從而為該蒙藥的進一步研究提供簡單、快速的方法。現報道如下。

1 儀器及試藥

1.1 儀器

TU－1901型雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；OSB－2100－CE型旋轉蒸發(fā)器（東京理化器械株式會社，埃朗科技國際貿易有限公司）；HH－S2型數顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；KH5200DE型數控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；AL204型電子天平（梅特勒－托利多儀器有限公司）；DS－Y350型高速多功能粉碎機（上海市頂帥工貿有限公司）。

1.2 試藥

蒙藥肋柱花，2015年購自內蒙古錫林郭勒盟西烏旗，經內蒙古醫(yī)科大學李驍副教授鑒定為龍膽科植物肋柱花 Lomatogonium rotatum（L.）Fries ex Nym的干燥全草；齊墩果酸（批號為150305，上海如吉生物科技公司）；香草醛、冰醋酸、高氯酸和無水乙醇均為分析純。

2 方法與結果

2.1 總皂苷含量測定

2.1.1 溶液制備

對照品溶液：稱取齊墩果酸對照品2.02 mg，精密稱定，用甲醇溶解，定容于10 mL容量瓶，混勻，得終質量濃度為0.202 g／L的齊墩果酸對照品溶液。

供試品溶液：稱取干燥的肋柱花粉末0.5 g，精密稱定，過5號篩[10]，用適量體積分數的乙醇超聲波提取一定時間，過濾，濃縮濾液，用對應體積分數的乙醇超聲溶解后定容于10 mL容量瓶中，搖勻，即得。

2.1.2 測定波長選擇

精密吸取供試品溶液或齊墩果酸對照品溶液適量，置10 mL容量瓶中，將溶劑揮干后加入新配制的5%香草醛 －冰醋酸溶液 0.2 mL 和高氯酸溶液 0.8 mL[11－13]，搖勻，于60℃恒溫水浴15 min，迅速冷卻10 min，加冰醋酸至刻度，搖勻，在可見光（400～800 nm波長）范圍內進行掃描。根據掃描圖譜，最終選取在最大吸收波長（546 nm）處測定吸光度（見圖 1）。

圖1 齊墩果酸紫外吸收光譜圖

2.1.3 方法學考察

標準曲線繪制[14]：分別精密吸取齊墩果酸對照品溶液 0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，按2.1.2項下方法進樣測定在546 nm波長處的吸光度，以吸光度值（Y）為縱坐標、齊墩果酸質量濃度（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y＝44.475 X－0.007 1， R2＝0.999 6（n＝7）。結 果 表明，齊墩果酸質量濃度在 2.02 ～ 20.2 μg／mL 范圍內與吸光度線性關系良好。標準曲線見圖2。

圖2 齊墩果酸標準曲線

精密度試驗：精密量取同一供試品溶液0.1 mL，按

2.1.2 項下測定方法于同一波長下連續(xù)測定吸光度6次。結果的 RSD為1.33%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液 0.1 mL，按 2.1.2 項下顯色方法，于室溫分別放置 0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60 min，在 546 nm 波長處測定吸光度。結果供試品溶液在20 min內的總皂苷含量分別為26.4，26.0，25.68，25.41，25.19 mg ／g，RSD 為 1.86%(n ＝5)，表明方法穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：精密稱取同一批樣品6份，依法制備供試品溶液并顯色，在同一波長（546 nm）下測定吸光度。結果供試品溶液中總皂苷含量的平均值為27.30 mg／g，RSD為1.67%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.1.4 含量測定方法

精密吸取供試品溶液0.1 mL，置10 mL容量瓶中，按2.1.2項下顯色方法，將溶劑揮干后于546 nm波長處測定吸光度。根據標準曲線讀出供試品溶液中所含齊墩果酸的質量，從而計算出總皂苷的含量。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分數

稱取肋柱花粉末0.5 g，精密稱定，維持液料比和提取時間不變，在不同乙醇體積分數（50% ～90%）下測定總皂苷含量，每個平行因素作3組。結果見圖3。可見，乙醇體積分數為80%時總皂苷提取量最高，故選擇70%，80%，90%乙醇進行優(yōu)化。

圖3 乙醇體積分數對總皂苷含量的影響

2.2.2 液料比

稱取肋柱花粉末0.5 g，精密稱定，維持乙醇體積分數和提取時間不變，在不同液料比（10～50 mL／g）下測定總皂苷含量，每個平行因素作3組。結果見圖4。可見，液料比為30 mL／g時總皂苷提取量最高，故選擇20，30，40 mL ／g的液料比進行優(yōu)化。

2.2.3 超聲時間

稱取肋柱花粉末0.5 g，精密稱定，維持乙醇體積分數和液料比不變，在不同超聲時間（20～60 min）下測定總皂苷的含量，每個平行因素作3組。結果見圖5。可見，超聲時間為30 min時總皂苷提取量最大，故選擇超聲時間在20，30，40 min時進行優(yōu)化。

圖4 液料比對總皂苷含量的影響

圖5 超聲時間對總皂苷含量的影響

2.3 響應面法優(yōu)化試驗

2.3.1 因素水平選擇

根據前期的單因素試驗，選取乙醇體積分數（因素A，% ），液料比（因素 B，mL ／g），超聲時間（因素 C，min）為自變量，以肋柱花總皂苷含量為響應值，設計3個因素3個水平對肋柱花超聲提取工藝進行優(yōu)化。響應面試驗設計及結果見表1和表2。

表1 響應面試驗設計因素水平表

2.3.2 模型建立及顯著性分析[15]

采用 Design－Expert 8.0.6.1 響應面分析軟件對17組試驗數據（表2）進行分析，得二元回歸方程：

由表 3可見，F模型＝8.65，P ＝0.004 8＜0.01，差異有統(tǒng)計學意義；P失擬＝0.512 4＞0.1，差異無統(tǒng)計學意義。在總的作用因素中，一次項，液料比差異極顯著，乙醇體積分數、超聲時間差異不顯著，由表3中 F值可知，影響總皂苷提取量的因素大小依次為B＞A＞C；交互項除AB（乙醇體積分數和液料比因素的交互作用）差異極顯著外，其余均無顯著影響；二次項，只有 A2（乙醇體積分數和乙醇體積分數交互作用）差異極顯著，其余均不顯著。

表2 響應面試驗結果

表3 響應面方差分析結果

2.3.3 各因素間交互效應分析[16]

圖6至圖8為擬合模型繪制的蒙藥肋柱花總皂苷的等高線及響應面圖。分析可見：1）乙醇體積分數固定不變時，液料比增加，總皂苷含量也隨之增加；液料比固定，乙醇體積分數增加，總皂苷含量先增加后減少；乙醇體積分數在75% ～85%時，總皂苷含量基本不變。2）乙醇體積分數不變時，超聲時間增加，總皂苷含量先上升后下降；當超聲時間不變時，乙醇體積分數增加，總皂苷含量也隨之上升，到達一定程度后，乙醇體積分數增加而總皂苷含量反而下降。當乙醇體積分數在75%～85%時，總皂苷含量最高且趨于穩(wěn)定。3）液料比不變時，隨著超聲時間的增加，總皂苷含量減少；而超聲時間不變時，總皂苷含量隨著液料比的增加而上升。

圖6 乙醇體積分數和液料比的等高線及響應面圖

圖7 乙醇濃度和超聲時間的等高線及響應面圖

圖8 液料比和超聲時間的等高線及響應面圖

2.3.4 提取工藝優(yōu)化

經分析軟件預測得到的提取參數條件為乙醇體積分數 77.1% ，液料比 40 mL ／g，超聲時間 32.95 min。實際操作條件修正為乙醇體積分數77%，液料比40 mL／g，超聲時間33 min。

2.4 驗證試驗

在優(yōu)化提取工藝條件下，精密稱取3份藥材樣品，按2.1.2項下方法對預測結果進行驗證試驗。結果供試品溶液的總皂苷含量分別為 27.03，27.48，27.57 mg／g，平均 27.36 mg／g，結果的 RSD 為 1.06% （n ＝ 3）。實測值與理論預測值(27.50 mg／g)非常接近。可見，對于多目標優(yōu)化肋柱花總皂苷提取工藝，響應面法具有可靠性和實際應用價值。

3 討論

本試驗中選取了3個因素（乙醇體積分數、液料比、超聲時間）作為考察肋柱花總皂苷含量影響的因素，通過單因素試驗采用 Design－Expert 8.0.6.1軟件設計出17組響應面優(yōu)化試驗，再根據結果進行分析，最終得到各個因素水平的相互作用，并作出形象又直觀的等高線圖及響應面圖。進而可初步篩選出各影響因素的最佳取值范圍[17]。

肋柱花為蒙醫(yī)常用藥，已作為主藥與其他藥材配伍用于各種疾病中。目前，對肋柱花化學成分研究相對較多的是黃酮類化合物，而對皂苷類成分研究較少見。因此，本試驗中旨在通過紫外分光光度法對肋柱花總皂苷提取方法作進一步優(yōu)化，為對肋柱花化學成分更深入的研究提供基礎依據。

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