氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定山藥中農(nóng)藥殘留的一測(cè)多評(píng)研究

陳 嵐 ，余敏靈 ，楊 佳 ，梁 華 ，李 根

（1.四川省成都市婦女兒童中心醫(yī)院，四川 成都 610091； 2.四川省樂(lè)山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川 樂(lè)山 614000）

近年來(lái)，隨著中藥材的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，農(nóng)藥污染問(wèn)題日益嚴(yán)重，農(nóng)藥殘留問(wèn)題始終制約著中藥走向國(guó)際化。2015年版《中國(guó)藥典（四部）》收載了多種有機(jī)氯類(lèi)、有機(jī)磷類(lèi)等農(nóng)藥殘留的氣相色譜檢查方法[1]。文獻(xiàn)中農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法多以氣相色譜（GC）法、液相色譜法、氣相色譜－質(zhì)譜（MS）聯(lián)用及液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用為主[2－8]，但都存在對(duì)照品獲得困難、操作煩瑣或多指標(biāo)檢測(cè)成本高的問(wèn)題。為此，本研究中應(yīng)用氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(GC－MS／MS)法，根據(jù)色譜保留時(shí)間和質(zhì)荷比信息對(duì)樣品進(jìn)行定性分析，以聯(lián)苯菊酯二級(jí)離子掃描色譜峰面積為參照，計(jì)算其與甲氰菊酯二級(jí)離子掃描色譜峰面積和溴氰菊酯二級(jí)離子掃描色譜峰面積的校正因子，建立GC－MS／MS法測(cè)定山藥[1]中聯(lián)苯菊酯等3種農(nóng)藥殘留的一測(cè)多評(píng)方法，結(jié)果滿意，可為GS－MS／MS測(cè)定農(nóng)藥殘留量提供一測(cè)多評(píng)[9－12]研究思路。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

GCMS－TQ8030型氣質(zhì)聯(lián)用儀，Rxi－5SilMS型毛細(xì)管柱（30 m × 0.25 mm，0.25 μm），工作站為 LabSolutions GCMS Solutions（4.20 版，島津中國(guó)科技有限公司）；Cleanert TPH凈化柱（天津博納艾潔爾公司）。

1.2 試藥

聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液（規(guī)格為100 μg／mL，批號(hào)分別為 GSB05－2333－2016，GSB05－2306－2016，GSB05－2310－2016）；乙腈、丙酮為色譜純，氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉均為優(yōu)級(jí)純。山藥樣品采購(gòu)于樂(lè)山中藥材有限公司，按2015年版《中國(guó)藥典（一部）》所載方法鑒定為薯蕷 Dioscorea opposita Thunb.的干燥根莖[13]，樣品批號(hào)分別為 20161001，20161002，20161003。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定條件

2.1.1 氣相色譜條件

色譜柱：采用 Rxi－5SilMS型毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃ ；線速度：47.2 cm ／s；程序升溫：50 ℃保持 1 min，以 25 ℃ ／min 的速率升至125℃，再以10℃ ／min的速率升至300℃，保持15 min；進(jìn)樣體積：1 μL；載氣：高純度氦氣（＞99.999%）。

2.1.2 質(zhì)譜條件

離子源溫度：200℃；接口溫度：250℃；溶劑延遲時(shí)間：5 min；碰撞氣：氬氣（純度大于 99.999% ）；電離方式：見(jiàn)表 1。

表1 3種農(nóng)藥的質(zhì)譜電離方式

2.2 溶液制備

標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：精密量取聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，置10 mL容量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液（每1 mL含聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯各 10 μg）。

樣品溶液：取山藥（批號(hào)為20161001）約50 g，粉碎成粉末（過(guò) 3號(hào)篩），稱(chēng)取粉末 1.023 1 g，精密稱(chēng)定，置50mL離心管中，加入15 mL乙腈，以15000 r／min的速率勻漿提取1 min，加入2 g氯化鈉，再勻漿提取1 min，以4 200 r／min的速率離心5 min，取上清液置150 mL雞心瓶中，再向離心管中加入15 mL乙腈，按上述方法重復(fù)勻漿提取1次，合并提取液，于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約1 mL。Cleanert TPH固相萃取柱上加入約2 cm高無(wú)水硫酸鈉，用10 mL正己烷 －丙酮（6∶4）預(yù)洗后，將樣品濃縮液移入柱中，用 25 mL正己烷 －丙酮（6∶4）洗脫，收集洗脫液于40℃水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，用丙酮定容至 1 mL，0.2 μm 濾膜濾過(guò)，即得。

空白溶液：除稱(chēng)取樣品粉末外，按上述操作制備空白溶液。

樣品加標(biāo)溶液：稱(chēng)取同一批(批號(hào)為20161001)山藥粉末1.031 0 g，精密稱(chēng)定，按樣品溶液的制備方法，自“置50 mL離心管中”起到“收集洗脫液于40℃水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至近干”，用丙酮轉(zhuǎn)移至1 mL容量瓶中，另取標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液1 mL置10 mL容量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，搖勻，精密量取此溶液5 μL置上述1 mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，搖勻，用0.2 μm濾膜過(guò)濾，即得。

2.3 圖譜解析

精密量取標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液 25 μL，置 5 mL容量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。按擬訂測(cè)定條件，取對(duì)照品溶液、樣品溶液、樣品加標(biāo)溶液、空白溶液分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。在對(duì)照品溶液二級(jí)離子掃描色譜圖中有聯(lián)苯菊酯（181.1 ／166.1，即母離子與子離子的 m ／z值之比，下同）、甲氰菊酯（265.1 ／210.1）和溴氰菊酯（252.9 ／93.0）色譜峰；保留時(shí)間，聯(lián)苯菊酯為17.514 min，甲氰菊酯為17.695 min，溴氰菊酯為 21.783 min；在空白溶液色譜圖和樣品溶液色譜圖中無(wú)上述色譜峰，在樣品加標(biāo)溶液色譜圖中有和對(duì)照品溶液色譜圖中保留時(shí)間一致的聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯二級(jí)離子掃描色譜峰。對(duì)照品溶液和樣品加標(biāo)溶液的二級(jí)離子碎片圖譜中，聯(lián)苯菊酯在 153.1，166.1，179.1 處（豐度比為 5 ∶100 ∶19，以166.1 為參比），甲氰菊酯在 89.0，172.1，210.1 處（豐度比為 40 ∶14 ∶100，以 210.1 為參比），溴氰菊酯在 77.0，93.0，171.9 處（豐度比為 22 ∶100 ∶84，以 93.0 為參比）均有二級(jí)離子碎片峰。

圖1 二級(jí)離子掃描色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液5，10，20，25，30，40，50 μL，分置 7 個(gè) 5 mL 容量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。按擬訂測(cè)定條件進(jìn)樣測(cè)定，以組分二級(jí)離子掃描（181.1 ／166.1）峰面積（A）對(duì)進(jìn)樣量（m，ng）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見(jiàn)表2。

精密度試驗(yàn)：精密量取標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液 20 μL，置5 mL容量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。按擬訂測(cè)定條件重復(fù)進(jìn)樣6次。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，儀器精密度好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密量取標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液20 μL，分別置6個(gè)5 mL容量瓶，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。按擬訂測(cè)定條件分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。可見(jiàn)，方法重復(fù)性好。

樣品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品加標(biāo)溶液，按擬訂測(cè)定條件，分別在 0，2，4，8，12，14，16，20，24 h 時(shí)進(jìn)樣。結(jié)果聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯二級(jí)離子掃描色譜峰面積變化不大，RSD 分別為 1.12% ，1.25% ，0.93%（n＝9），表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

檢出限與定量限確定：取樣品加標(biāo)溶液，按擬訂測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得信噪比（S／N），以 S／N＝3計(jì)算最低檢出限，S／N＝10計(jì)算最低定量限。結(jié)果見(jiàn)表2。

回收率試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下山藥粉末9份，分為3組，每組3份，每份約1 g，精密稱(chēng)定，分置9個(gè)50 mL離心管中，每組分別加入標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液 4，5，6 μL，依法制備樣品溶液，取樣品溶液，按擬訂測(cè)定條件分別進(jìn)樣，記錄圖譜。按回歸方程 A＝10 388 461 m－236計(jì)算供試品中聯(lián)苯菊酯含量，按校正方程 A甲＝10388461 mf甲／聯(lián)－236計(jì)算甲氰菊酯含量，按校正方程 A溴＝10 388 461 mf溴／聯(lián)－236計(jì)算溴氰菊酯含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

圖2 二級(jí)離子碎片圖譜

表2 線性關(guān)系考察、精密度、重復(fù)性及檢出限與定量限試驗(yàn)結(jié)果

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

f值和 t值測(cè)定：甲氰菊酯與聯(lián)苯菊酯色譜峰峰面積的校正因子 f甲／聯(lián)＝523 142／10 388 461＝0.050 4，相對(duì)保留時(shí)間 t甲／聯(lián)＝17.695 ／17.514 ＝1.010 3；溴氰菊酯與聯(lián)苯菊酯色譜峰峰面積的校正因子 f溴／聯(lián)＝520 881／10 388 461＝0.050 1，相對(duì)保留時(shí)間 t溴／聯(lián)＝21.783 ／17.514 ＝ 1.243 7。

f值耐受性考察：實(shí)際應(yīng)用中，色譜條件可能會(huì)有一些變化，故對(duì)線速度、進(jìn)樣體積等可能影響 f值的因素進(jìn)行考察，結(jié)果 f值的波動(dòng)不大。詳見(jiàn)表4。

2.5 樣品中農(nóng)藥殘留量測(cè)定

分別取3批山藥樣品約50 g，分別粉碎成粉末（過(guò)3號(hào)篩），分別取粉末約1 g，精密稱(chēng)定，依法制備樣品溶液，取樣品溶液按擬訂測(cè)定條件分別進(jìn)樣，記錄圖譜，計(jì)算樣品中聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯殘留量。結(jié)果見(jiàn)表5。

3 討論

以聯(lián)苯菊酯為對(duì)照品測(cè)定樣品中3種農(nóng)藥殘留，其原理是利用樣品色譜圖中聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯的色譜峰相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行定位[2]，以及二級(jí)離子碎片圖譜碎片離子峰和豐度比對(duì)聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯色譜峰進(jìn)行定性分析。定量分析，通過(guò)精密量取聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和溴氰菊酯對(duì)照品溶液各適量，配制成不同濃度的混合溶液，按設(shè)定條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，繪制進(jìn)樣量對(duì)其峰面積的回歸曲線，以聯(lián)苯菊酯回歸曲線斜率與甲氰菊酯、溴氰菊酯回歸曲線斜率的比值計(jì)算校正因子（fsk＝Ks／Kk），通過(guò)聯(lián)苯菊酯回歸曲線計(jì)算聯(lián)苯菊酯含量，通過(guò)校正因子及聯(lián)苯菊酯回歸曲線計(jì)算甲氰菊酯、溴氰菊酯含量。

表4 相對(duì)校正因子耐受性考察結(jié)果

表5 3批樣品中3種農(nóng)藥殘留量測(cè)定結(jié)果（ng／kg）

GC－MS聯(lián)用法和GC－MS／MS法既具有GC的高分離效能，又具有MS可鑒定化合物結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，可同時(shí)快速測(cè)定樣品中多種殘留農(nóng)藥及其衍生物。本研究中采用的一測(cè)多評(píng)法，通過(guò)設(shè)定1種對(duì)照品，建立該成分與其他成分間的相對(duì)響應(yīng)因子，再用該因子計(jì)算其他成分含量。一測(cè)多評(píng)法具有成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)，能有效解決多指標(biāo)質(zhì)量控制面臨的對(duì)照品短缺、不易獲得、檢測(cè)成本相對(duì)昂貴和農(nóng)藥對(duì)照品造成環(huán)境污染等問(wèn)題，是較常用的一種質(zhì)量控制方法。然而，中藥材往往含有多種成分，且其中某些成分可能對(duì)測(cè)定產(chǎn)生干擾。因此，使用一測(cè)多評(píng)法對(duì)中藥材殘留農(nóng)藥進(jìn)行含量測(cè)定，尤其在測(cè)定某一具體品種時(shí)應(yīng)設(shè)計(jì)具體的試驗(yàn)參數(shù)，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

校正因子計(jì)算法常應(yīng)用于化學(xué)藥中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定，以及中藥材及其復(fù)方制劑中多指標(biāo)成分的測(cè)定。校正因子的表示方法很多，本試驗(yàn)中是指氣相色譜法的相對(duì)質(zhì)量校正因子。測(cè)定時(shí)，可精密稱(chēng)（量）取1個(gè)成分對(duì)照品和其他物質(zhì)對(duì)照品各適量，分別配制成不同濃度的溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，繪制選定成分進(jìn)樣量和其他成分進(jìn)樣量對(duì)其峰面積的回歸曲線，以其回歸直線斜率之間的比值計(jì)算。

本試驗(yàn)中采用乙腈提取，經(jīng)Cleanert TPH專(zhuān)用凈化柱凈化，根據(jù)色譜相對(duì)保留時(shí)間和質(zhì)荷比信息對(duì)樣品進(jìn)行定性分析，以聯(lián)苯菊酯二級(jí)離子掃描峰面積為參照，成功建立了以聯(lián)苯菊酯為對(duì)照品測(cè)定山藥中聯(lián)苯菊酯等3種農(nóng)藥殘留量的GC－MS／MS方法。一般而言，當(dāng)色譜條件有細(xì)微改變時(shí)，相對(duì)保留時(shí)間有細(xì)微變化，故需考察該時(shí)間耐受性。本試驗(yàn)中未作考察，是因?yàn)楸粶y(cè)定物質(zhì)的定性主要采用二級(jí)離子碎片峰及其豐度比確認(rèn)；又因乙腈對(duì)農(nóng)藥溶解度較大，可溶入的雜質(zhì)量適中，故選擇乙腈為提取液。另外，本試驗(yàn)中還在Cleanert TPH固相萃取柱上加入約2 cm高的無(wú)水硫酸鈉，以除去樣品溶液及洗脫液中的水分，從而充分凈化樣品，進(jìn)一步保證檢測(cè)質(zhì)量。

綜上所述，本研究中建立的一測(cè)多評(píng)法簡(jiǎn)單，快速，定量準(zhǔn)確，適用于山藥中聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯農(nóng)藥殘留的測(cè)定。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（四部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：209 －223.

[2]張 羽中，郎 朗.中藥材中農(nóng)藥殘留分析的研究進(jìn)展[J].黑龍江醫(yī)藥，2015，28（2）：235 － 238.

[3]孔令軍，張婭婷，谷令彪，等.中藥材農(nóng)藥殘留的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（21）：231 － 234.

[4]傅巧真，路俊仙，王 萌，等.中藥材農(nóng)藥殘留原因及防治措施的研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2014，25（4）：925 －927.

[5]劉 芳，歐陽(yáng)慧子，柴士偉，等.GC法檢測(cè)72種中藥飲片有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量[J].中國(guó)藥房，2016，27（36）：5147 － 5150.

[6]殷玉潔，夏秀萍，毛福英，等.藥用植物中農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2017，28（12）：1721 － 1726.

[7]李冬華，馬 瀟，趙建邦，等.我國(guó)市售藥材中64種農(nóng)藥殘留的本底調(diào)查與檢測(cè)分析[J].西部中醫(yī)藥，2011，24（12）：7－10.

[8]劉 姣，劉雪峰，樊寶娟.GC－MS法測(cè)定18種藥材中的農(nóng)藥殘留量[J].西北藥學(xué)雜志，2017，32（1）：9 －13.

[9]徐賽華，沈昱翔.一測(cè)多評(píng)法測(cè)定重樓藥材中4種皂苷類(lèi)成分含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2017，36（9）：1029 － 1033.

[10]王 欣，覃 瑤，孫建彬，等.一測(cè)多評(píng)法測(cè)定黃連須中的5種生物堿[J].華西藥學(xué)雜志，2017，32（4）：417 －420.

[11]于雪娥，秦建平，李家春，等.一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定淫羊藿總黃酮膠囊中7種黃酮類(lèi)成分[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（7）：79 － 85.

[12]劉 峰，馬久太，王浩仁，等.一測(cè)多評(píng)法測(cè)定沙棘鮮果中槲皮素、山柰素和異鼠李素含量[J].中國(guó)藥業(yè)，2017，26（13）：24 － 27.

[13]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：28.