GB 4789.15－2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》標準解讀

馬群飛

2016年11月18日，國家衛生和計劃生育委員會網站公布了一系列食品安全國家標準，其中GB 4789.15－2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》（以下簡稱2016版標準）實施日期為2017年4月19日[1]。這個標準方法在目前各個食品檢驗機構和企業微生物實驗室使用頻率比較高。在2016版標準的前言中，雖然描述了對GB 4789.15－2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》[2]修改的主要章節，但是沒有明確是如何修訂的。因為在具體操作細節方面要求更為細致，檢驗機構困惑較多，實際工作中也可能出現偏差，影響標準的實施效果。為了幫助微生物檢驗人員更好地理解標準的變化，我們對2016版標準進行解讀。

1 范圍

2016版標準的前言中，沒有描述對于“范圍”這個章節進行了修改。除了將原來使用的術語“霉菌和酵母菌”按照標準名稱統一規范為“霉菌和酵母”外，標準規定“第二法適用于番茄醬罐頭、番茄汁中霉菌的計數。”此處“罐頭”這個名詞運用的不準確。實際上，只要是番茄醬、番茄汁，無論是否罐頭，或其他包裝形式，都適用于第二法檢驗。

2 設備和材料

2016版標準將均質器類型明確為拍擊式均質器或均質袋（2.2）。以往版本標準是規定采用振蕩的方式來進行樣品表面的沖洗，均質程度不足。另外有些檢驗機構，使用旋轉刀片均質器，可能會把霉菌的菌絲切斷，導致檢驗結果偏高。所以，2016版標準對均質方式進行了明確的規定。無菌試管規格由10 mm×75 mm修改為18 mm×180 mm（2.6）。使用較為粗大的試管，有利于樣品稀釋液的混勻，否則在小試管里面很難充分混勻。增加了微量移液器及吸頭1.0 mL（2.11），這是為了兼容檢驗機構實際工作中常用的方式。建議購買可整支高壓滅菌的移液器，避免因反復吹吸導致微生物污染。刪除了500 mL無菌廣口瓶、牛皮紙袋這一類包裝材料，原因是現在檢驗機構的使用率很低。刪除了標準中沒有用到的冰箱和恒溫振蕩器，增加了漩渦混合器和恒溫水浴。主要是反復吹吸方式混勻樣品稀釋液，容易形成有害氣溶膠，并增加污染機會，用漩渦混合器可以保證樣品稀釋液的均勻，減少污染。恒溫水浴主要為了準確控制傾注瓊脂的溫度。對于郝氏計測玻片（2.13），還是沿用了以往的翻譯習慣，但缺少了相應的英文描述，容易引起歧義，最好是描述為“郝氏（Howard）計測玻片”。

3 培養基和試劑

2016版標準中增加了生理鹽水和磷酸鹽緩沖液，保留無菌蒸餾水作為稀釋液。增加兩種稀釋液，也是為了配合實驗室工作，因為經常是同一份食品樣品，需要同時檢驗菌落總數、大腸菌群、霉菌和酵母等等多個微生物項目。若每一份都重新稱重更換稀釋液，實驗室工作量太大，也難以保證落實。而生理鹽水和磷酸鹽緩沖液對于生物細胞的保護作用明顯優于無菌蒸餾水。實際上，僅僅是檢驗高鹽食品（如水產調味品、腌菜等）時，無菌蒸餾水可能更適用。另外，將“馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養基”書寫方式改為“馬鈴薯葡萄糖瓊脂”，“孟加拉紅培養基”改為“孟加拉紅瓊脂”。

4 檢驗程序

流程圖稍有修改。蒸餾水改為稀釋液，明確了樣品勻液的添加方式，以及培養基添加量明確在20 mL以上。

5 操作步驟

5.1 樣品的稀釋

本條除了稀釋步驟，還規定了樣品接種和空白對照。所以，本條標題應該是“樣品稀釋和接種”。另外，5.1.1對于固體和半固體樣品的稀釋，允許“充分振搖”。這樣描述，會導致一些檢驗機構對于塊狀食品樣品振搖后就進行下一步操作，微生物還沒有從食品團塊中釋放出來，影響檢驗效果。2016版標準中，除了增加了生理鹽水及磷酸鹽緩沖液外，還將每平皿中馬鈴薯葡萄糖瓊脂和孟加拉紅瓊脂的添加量由15 mL～20 mL改為20 mL～25 mL（5.1.6），這是為了符合GB 4789.28－2013《食品安全國家標準 食品微生物檢驗 培養基和試劑的質量要求》對于培養時間超過48 h的培養基應傾注4 mm左右的厚度和20 mL以上量的強制性規定[3]。增加了“置水平臺面待培養基完全凝固”的規定。雖然標準規定梯度稀釋時可以用無菌吸管反復吹吸，但是為了避免形成有害氣溶膠，減少污染機會，建議檢驗機構盡量使用漩渦混合器來混勻稀釋液。

5.2 培養

2016版標準將培養方式修改為平板應正置培養，是為了避免在培養過程中，因為需要多次觀察而反復上下反轉平板導致霉菌孢子擴散形成次生小菌落，最終影響計數結果。把“培養5 d，觀察并記錄”修改為“觀察并記錄培養至第5 d的結果。”避免培養到5 d后才進行觀察，而出現霉菌菌落已經蔓延無法計數甚至導致培養箱污染的情況。因為光照會促進孟加拉紅分解，美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，FDA）的霉菌和酵母檢驗方法也專門規定在暗處培養[4]，所以，雖然2016版標準中未規定，檢驗機構也應避免使用透明門的培養箱或將平板放在有光照的條件下培養。

5.3 菌落計數

將上一個版本“霉菌蔓延生長覆蓋整個平板的可記錄為多不可計”這個錯誤規定修改為“霉菌蔓延生長覆蓋整個平板的可記錄為菌落蔓延”。本條的主要技術問題是如何“根據菌落形態分別計數霉菌和酵母”，畢竟霉菌和酵母不是分類學的名詞，單從菌落外觀進行區別判定容易引起爭議。而在ISO標準中，就有較為明確的描述[5]。在被2016版標準替代的SN/T 2552.3－2010《乳及乳制品衛生微生物學檢驗方法 第3部分：酵母、霉菌菌落計數》中，規定“排除可能生長的異常細菌菌落。必要時，根據形態學特征區分酵母和霉菌菌落”[6]，這樣的描述似乎更合理。畢竟某些細菌可能耐受抗生素而形成菌落造成計數干擾，通過形態學特征（如低倍鏡檢等）可以區分霉菌和酵母及細菌菌落。FDA和ISO的標準方法也有類似要求[4-5]。建議檢驗機構通過作業指導書形式來完善這部分步驟。

6 結果與報告

6.1 結果

增加了兩種結果的計算方法：若有兩個稀釋度平板上菌落數均在10 CFU～150 CFU，則按GB 4789.2的公式進行計算（6.1.2）[7]。因為這種情況還是比較經常出現的。若所有稀釋度的平板菌落數均不在10 CFU～150 CFU，其中一部分小于10 CFU或大于150 CFU時，則以最接近10 CFU或150 CFU的平均菌落數乘以稀釋倍數計算（6.1.6）。這些都是原來標準沒有規定的。

6.2 報告

以前的霉菌和酵母計數標準中，對計數結果的最終報告方式缺少詳細的規定。2016版標準參照了GB 4789.2的計數方法[7]，增加了“若空白對照平板上有菌落出現，則此次檢測結果無效”的內容（6.2.3）。明確了“菌落數在10以內時，采用一位有效數字報告”（6.2.1）。上個版本，是規定“菌落數在100以內時，按照四舍五入原則修約，采用兩位有效數字報告。”例如有的檢驗機構就按照這樣的規定，將10以內的菌落數報告成8.5。

7 操作步驟（第二法 霉菌直接鏡檢計數法）

這個章節，主要是增加了7.6報告條款，明確了最終的報告方式為“視野%”。存在的問題，一是“7.3 涂片：洗凈郝氏計測玻片，將制好的標準液，用玻璃棒均勻的攤布于計測室，以備觀察”。這里的“標準液”，其實應該是“樣品稀釋液”。二是“7.5 結果與計算：……或三根菌絲總長度超過標準視野的1/6（即測微器的一格）時即記錄為陽性（＋）”，實際上，標準視野的1/6并不是測微器的一格。這兩處都屬于描述錯誤。

8 附錄A 培養基及試劑

2016版標準的這個章節中，增加了生理鹽水、磷酸鹽緩沖液配方。其余技術性修改，主要是將馬鈴薯葡萄糖瓊脂和孟加拉紅瓊脂的滅菌時間由2010版本的20 min修改為15 min（A.2.2、A.3.2），并增加了對孟加拉紅瓊脂避光保存備用的要求，因為太長時間的高壓滅菌可能會破壞糖類，光照會促進孟加拉紅分解。另外，刪除了2010版本“傾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培養基中”的規定[2]，因為氯霉素能夠耐高壓滅菌，可以直接添加在培養基中再殺菌，這樣就簡化了相對繁瑣的配制步驟。

9 存在的問題

2016版標準依然沒有解決兩個技術問題：一是沒有改變使用28℃培養，與美國FDA或ISO標準用較低溫度（25℃）培養的技術性差異問題[4，5，8]；二是沒有明確如何區分霉菌和酵母的菌落形態分別計數報告的問題。期待隨著檢驗技術的不斷進步，未來版本的標準能夠予以解決。

[1] 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會. GB 4789.15－2016. 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數[S]. 2016. 引用時間：20170419. 網址：http://bz.cfsa.net.cn/staticPages/32AA7ED2-89E4-4660-8194-C5FC7EE00856.html.

[2] 中華人民共和國國家衛生部. GB 4789.15－2010. 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數[S]. 2010.引用時間：20170808. 網址：http://bz.cfsa.net.cn/staticPages/F39FC94AC37D-44D6-A3A7-2997FEAA7B5F.html.

[3] 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會. GB 4789.28－2013. 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 培養基和試劑的質量要求[S]. 2013. 引用時間：20170808.網址：http://bz.cfsa.net.cn/staticPages/3B34B8D6-7164-4419-B308-6AF683E8B606.html.

[4] Food and Drug Administration.Bacteriological Analytical Manual Chapter 18: Yeasts，Molds and Mycotoxins[S].2001. 引用時間：20170808. 網址：https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm071435.html.

[5] International Organization for Standardization. ISO 21527-1:2008.Microbiology of food and animal feeding stuffs － Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds － Part 1: Colony count technique in products with water activity greater than 0，95[S].2008. 引 用 時 間：20170808. 網 址：https://www.iso.org/obp/ui/#iso:std:iso:21527:-1:ed-1:v1:en.

[6] 中華人民共和國國國家質量監督檢驗檢疫總局. SN/T 2552.3－2010.乳及乳制品衛生微生物學檢驗方法 第3部分：酵母、霉菌菌落計數[S]. 2010. 引用時間：20170808.網址：http://www.eshian.com/standards/18265.html.

[7] 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會，中華人民共和國國家食品藥品監督管理總局. GB 4789.2－2016. 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定[S]. 2016. 引用時間：20170808. 網址：http://bz.cfsa.net.cn/staticPages/F23DE741-721F-4C68-BDB1-F42440C66858.html.

[8] International Organization for Standardization. ISO 6611:2004.Milk and milk products—Enumeration of colony-forming units of yeasts and/or moulds—Colony-count technique at 25℃ [S]. 2004. 引用時間：20170808. 網址：https://www.iso.org/standard/40473.html.