miRNA-198表達異常與難治性糖尿病潰瘍的相關性研究

王 娟，侯俊秀，張川江

(1.內蒙古醫科大學附屬醫院內分泌科，呼和浩特 010050；2.內蒙古精神衛生中心心身科，呼和浩特 010010)

MicroRNA(miRNA)是一種非編碼RNA，可以靶向結合信使RNA(mRNA)并發揮降解或抑制其翻譯的作用，然后實現轉錄后基因表達的相關調控效果。近年來人們發現，miRNA 作為基因表達調控分子中的重要一員，在皮膚發育、多種皮膚病以及皮膚潰瘍和創傷愈合過程也同樣具有重要的調節作用[1-3]。近年來國內外相關研究也開始更多地關注其與皮膚創傷愈合的相關性及其在潰瘍等愈合中所起到的作用[4-5]。國外有研究提示，健康皮膚受損時miR-198 生成停止，可見miR-198 水平降低，提示機體開啟傷口愈合通道。糖尿病性潰瘍是一種病程遷延且病情復雜、處理困難的并發癥，且預后相對較差，往往久治不愈，嚴重影響患者的生活質量，這種未愈合的傷口中長期存在miR-198，會抑制傷口愈合[6-7]。本文就外周血miRNA-198表達異常與難治性糖尿病潰瘍的相關性進行了初步探索，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年7月至2017年7月在內蒙古醫科大學附屬醫院就診的48例2型糖尿病并發慢性難治性潰瘍的患者作為潰瘍組，其中男29例、女19例，平均年齡(58.29±7.03)歲，平均糖化血紅蛋白(HbA1c)水平為(9.93±2.45)%，平均糖尿病病程(15.98±3.27)年；同時選取年齡、性別具有可比性的新診斷的65例2型糖尿病無任何急、慢性并發癥患者作為單純糖尿病組，其中男40例、女25例，平均年齡(57.23±9.88)歲，平均HbA1c水平為(9.94±3.82)%，平均糖尿病病程(15.55±4.02)年；另選擇同期65例健康人作為健康組，其中男39例、女26例，平均年齡(58.04±6.39)歲，平均HbA1c水平為(5.01±0.88)%。潰瘍組和單純糖尿病組患者HbA1c水平均高于健康組，差異有統計學意義(P<0.05)。3組研究對象性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有糖尿病患者均符合1999年WHO關于 2型糖尿病診斷標準，排除合并其他嚴重并發癥和其他嚴重疾病及自身免疫性疾病者。所有受試者對本研究知情同意，并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 miRNA-198的測定采用實時定量聚合酶鏈反應(PCR)技術，主要試劑及儀器為miRNeasy血清/血漿RNA提取試劑盒、miRNeasy血清/血漿外參，均購自德國Qiagen公司；熒光定量PCR引物、TaqMan通用混合熒光定量PCR試劑盒Ⅱ、TaqMan MicroRNA反轉錄試劑盒、ABI9700型PCR儀、ABI 7900HT Fast Read-TimePCR System，均購自美國ABI公司。

1.3方法 對全部受試對象進行面訪，通過問卷調查收集患者超重/肥胖、高血壓現病史、高血壓家族史及糖尿病家族史等相關信息。然后將Ficoll-Paque PLUS液室溫放置，應用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管收集患者早晨空腹靜脈血5 mL，取2 mL EDTA抗凝血與等體積平衡液在15 mL離心管中用移液管充分混勻，用針管抽取3 mL Ficoll Paque PLUS液至新的離心管中，輕輕用移液管沿管壁緩慢滴加準備好的樣品于分層液面上離心。將血漿置于凍存管中，于-80 ℃環境下保存備用。采用血液總RNA快速提取試劑盒(miRNeasy血漿提取試劑盒)提取總RNA。按照miRNA反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄反應。實時熒光定量PCR按照TaqMan通用混合試劑盒Ⅱ說明書進行。PCR Ct值通過ABI 9700實時熒光定量PCR儀進行測定，每個反應重復2次。測定并比較患者血清中miRNA-198表達水平，對miRNA-198表達水平與難治性潰瘍之間潛在相關性進行分析。

2 結 果

2.1各組受試者超重/肥胖、糖尿病家族史、高血壓現病史、高血壓家族史情況 潰瘍組和單純糖尿病組患者中超重/肥胖、糖尿病家族史、高血壓現病史、高血壓家族史比例均高于健康組，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 受試者超重/肥胖、高血壓現病史、糖尿病家族史、 高血壓家族史情況情況比較[n(%)]

注：與健康組相比，*P<0.05

2.23組受試者外周血中miRNA-198的表達情況比較 潰瘍組患者外周血miRNA-198表達水平為(2.67±0.42)Ct，單純糖尿病組為(2.43±0.42)Ct，健康組為(2.43±0.21)Ct，3組miRNA-198表達水平差異有統計學意義(P<0.05)。進一步作兩兩比較發現，潰瘍組水平分別高于單純糖尿病組和健康組水平，差異有統計學意義(P<0.05)；單純糖尿病組與健康組間差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 miRNA-198表達水平及其他相關潛在影響因素與糖尿病難治性潰瘍之間的相關性

2.3miRNA-198表達水平及相關潛在影響因素與糖尿病難治性潰瘍之間的相關性 研究發現，miRNA-198表達水平增高可以增加1.679倍糖尿病難治性潰瘍的風險(OR值為1.679，P<0.01)；此外，超重/肥胖、高血壓現病史以及高血壓和糖尿病家族史都可以增加患糖尿病難治性潰瘍的風險(OR值分別為1.242、1.317、1.094、1.176,P<0.01)。見表2。

3 討 論

糖尿病本身是由遺傳因素、免疫功能因素以及環境因素等眾多致病因子作用下，機體出現胰島功能減退以及胰島素抵抗等而引發的糖代謝紊亂，同時還常常伴有蛋白質、脂肪、水和電解質等一系列代謝的穩態失衡，是一種臨床上常見的慢性疾病，以高血糖為主要特點[8-9]。糖尿病慢性并發癥發生率越來越高，全球每年約有320 萬人死于糖尿病的各種并發癥，慢性并發癥已經成為糖尿病患者致殘致死的主導因素。其中糖尿病性潰瘍是一種病程遷延且病情復雜、處理困難的并發癥，且預后相對較差，往往久治不愈，嚴重者還有可能導致截肢致殘。糖尿病潰瘍嚴重影響患者的生活質量，而且由于治療尚缺乏高效手段，治療周期長，加之醫療費用相對也較高，給患者家庭及社會都帶來沉重的負擔[8-10]。因此，對于糖尿病性潰瘍，特別是難治性糖尿病性潰瘍，深入探究其機制，尋求更高效的防治手段，意義重大。

我國糖尿病并發足部潰瘍引發的截肢患者近年也有所增加。糖尿病諸多慢性并發癥中包含大血管病變，比如心臟病、高血壓、腦血管意外以及下肢血管病變等；還有微血管病變，比如糖尿病視網膜病變、糖尿病腎病及神經病變等等[10-12]。其中糖尿病引發的潰瘍以及下肢動脈和靜脈疾病引起的難愈合型的潰瘍及創面已經成為糖尿病患者所面臨的主要危害之一。高血糖環境會引發創面無法有序、及時地修復，傷口逐漸形成潰瘍，因此糖尿病并發慢性潰瘍的發生率很高，而且潰瘍創面往往反復發作成遷延狀態[13-14]。

目前認為神經病變、缺血和創傷是造成糖尿病創面難以愈合的最重要因素[13-15]。隨著分子生物學及其相關技術的不斷發展，學者也在不斷探索糖尿病潰瘍性病變的分子機制以及微觀層面的特征。本研究針對外周血miRNA 表達狀態進行了分析，提示3組受試者miRNA-198表達水平存在差別,進一步做兩兩比較發現，潰瘍組水平分別高于單純糖尿病組和健康組水平，差異均有統計學意義(P<0.05)，單純糖尿病與健康組間差異無統計學意義(P>0.05)。其原因可能是糖尿病患者未愈合的傷口組織中長期存在miR-198，其在受損皮膚中高表達抑制了正常的皮膚受損miR-198 生成。鑒于miRNA是一種高度保守的非編碼RNA，在其調控各種病理生理的過程中是否會受到其他環境及患者自身因素的影響。本文就miRNA-198表達水平及其他相關潛在影響因素與糖尿病難治性潰瘍之間的相關性進行了回歸分析，結果提示miRNA-198表達水平高、超重/肥胖狀態、飲酒史、高血壓現病史以及高血壓和糖尿病家族史均是糖尿病難治性潰瘍發生的高危因素。其原因可能是這些因素均會加劇局部炎癥，使患者皮膚易感性增加，同時長期的慢性創面感染狀態引發的細菌感染和局部肉芽老化等病理過程的出現，以及包膜纖維化出現，都可以致創面不易愈合[15]。

綜上所述，miRNA-198的表達與難治性糖尿病性潰瘍之間存在相關性，miRNA-198在外周血中的表達增高存在于難治性糖尿病性潰瘍的病理過程之中，影響了傷口的正常愈合機制。

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