GUCY1A3基因位點rs7692387單核苷酸多態性與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的相關性研究

周爽，尤昕

（延邊大學附屬醫院檢驗科，吉林 延吉 133000）

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary atherosclerotic heart disease，CAD）（簡稱冠心病）是1種全球范圍內常見的慢性病，已經成為導致人類死亡的最主要病因之一。冠心病的發病機制復雜，目前普遍認為受環境和遺傳兩大因素的共同影響，隨著分子遺傳生物學的迅速發展，對其遺傳因素方面的研究也越來越受到重視[1]。自人類基因組計劃實施以來，人們對冠心病有更加深入了解，文獻表明，遺傳因素在冠心病發病過程中的貢獻高達50%[2]。近年來，全基因組關聯分析（genome-wide association studies，GWAS）被廣泛應用于復雜多基因疾病的研究之中，以單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）為基礎的全基因組關聯分析已成為研究冠心病遺傳易感性的主流方法，通過該方法研究發現的冠心病相關基因位點已達50多個[3]。GUCY1A3基因位于4號染色體q32.1，長77353 bp，含有13個外顯子，編碼690個氨基酸，這些氨基酸組成可溶性鳥苷酸環化酶（soluble guanylate cyclase，sGC）的(α1亞基。GUCY1A3基因已被認為在CAD的高遺傳風險中發揮著重要作用[4]。可溶性鳥苷酸環化酶（soluble guanylyl cyclase，sGC）作為1種信號轉導酶廣泛分布于人體中，并介導心血管系統的許多生理過程，例如促進血管平滑肌舒張，抑制血小板聚集和血管重構等，因此sGC成為維持心血管穩態的關鍵酶[5]。該試驗選取GUCY1A3基因位點rs7692387進行研究，分析其單核苷酸多態性與延邊地區漢族人群CAD遺傳易感性之間的關系，為開展針對性的人群預防提供新線索，同時也為延緩或防止CAD的發生提供更多的理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取延邊大學附屬醫院心血管內科住院且相互之間無血緣關系的漢族冠心病患者204例，均符合世界衛生組織制定的缺血性心臟病的診斷標準，且經冠狀動脈造影檢查證實至少1支冠脈狹窄≥50%。對照組201例選自延邊大學附屬醫院健康體檢科體檢結果正常，且通過詢問病史、輔助檢查等明確排除心血管疾病的健康人。通過查閱病案資料、問卷訪談等形式收集研究對象的基本資料及既往病史等，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 試劑

DNA提取試劑盒（美國Promega公司），SNaPshot試劑盒：ABI PRISM SNa Pshot Multiplex Kit（美國ABI公司），Taq酶：KAPA Taq Hot Start DNA Polymerase（Kapabiosystems公司），SAP 酶（Fermentas公司）、ExoI酶和CIP酶（NEB公司），瓊脂糖（美國Invitrogen公司）。

1.3 儀器與設備

Beckman Allgre 21R高速冷凍離心機（Beckman公司），BC-subMIDI電泳儀（北京六一儀器廠），JY300 C電泳槽（北京君意東方電泳設備有限公司），Bio Sens SC 810B凝膠成像儀（上海山富科學儀器有限公司），PTC-100PCR儀（MJ公司），ABI 9700擴增儀（ABI公司），3730XL測序儀（美國ABI公司）。

1.4 試驗方法

研究對象的GUCY1A3基因位點rs7692387的基因型及等位基因的檢測過程主要包括設計合成引物、提取DNA、預擴增、預擴增產物純化、延伸反應、延伸產物純化、上機檢測及整理分析數據。根據Genbank獲得的GUCY1A3基因所在序列的信息，應用Primer 5.0軟件設計rs7692387位點的特異性引物。正向引物：5'-CACTTCACTGTGGAAAC（C/T）GAG-3'，反向引物：5'-GTGCCTACAATGATGCCTGG-3'。入選的研究對象均在清晨空腹狀態下采集外周靜脈血2 ml于抗凝管中，室溫搖勻后置-20℃冰箱冷凍保存備用，采用DNA提取試劑盒按使用說明書提取并純化DNA。以聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增含有目的位點的基因片段。PCR反應體系包含提取 DNA（10～20 ng/μl）2 μl，2.5×BufferⅣ 4.0 μl，Taq（5 u/L）0.15 μl，引物（5 μmol，F+R）1.5 μl，加去離子水至10 μl。PCR擴增條件為95℃預變性5 min，95℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共35個循環，72℃終末延伸10 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳質檢。將所得產物用ExoI酶消化后純化再加入延伸體系，延伸體系包括消化后預擴增產物1.2 μl，Primers Mix 2 μl，ABI Mix 0.5 μl，10×Buffer I 0.4 μl，加去離子水至5 μl。將所得延伸產物純化后加入3730XL測序儀，采用美國ABI公司開發的Sna Pshot技術進行檢測，該技術是基于熒光標記單堿基延伸原理的1種分型技術。最后應用分析軟件將檢測所得的原始數據文件進行整理分析。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。兩組研究對象的基因型分布采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗其是否具有群體代表性。等位基因頻率及基因型頻率分布差異情況采用χ2檢驗進行分析。應用Logistic回歸分析校正混雜因素對冠心病的影響，并計算值和95%可信區間（95%CI），以檢測GUCY1A3基因位點rs7692387單核苷酸多態性和冠心病的相關性，以雙側P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象的一般臨床資料比較

冠心病組和對照組在性別、年齡、BMI、收縮壓、舒張壓、糖尿病史、TC及TG方面比較差異無統計學意義（P ＜0.05），研究對象平均年齡符合冠心病的高發年齡。冠心病組高血壓、吸煙史及LDL-C均高于對照組，HDL-C低于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表 1。

表1 兩組的臨床資料比較

2.2 基因測序結果

研究對象的GUCY1A3基因位點rs7692387共有3種基因型（見圖1）：純合子GG、AA，雜合子GA，純合子基因型顯示的峰型是單峰，雜合子基因型顯示的峰型是套峰。延伸體系中包含4種熒光標記的ddNTP，分別用藍色、黑色、綠色、紅色代表延伸加入ddGTP、ddCTP、ddATP及ddTTP的延伸產物，根據峰的顏色可得知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型。

2.3 兩組GUCY1A3基因位點rs7692387單核苷酸多態性與冠心病的關系

兩組分別進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，兩組研究對象GUCY1A3基因位點rs7692387基因型頻率的觀察值與理論預測值比較差異無統計學意義（P ＜0.05），表明該研究的人群符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。GUCY1A3基因位點rs7692387 G/A多態性檢測結果顯示，冠心病組GG基因型頻率高于對照組，而對照組GA+AA基因型頻率高于冠心病組，差異有統計學意義（P ＜0.05），G和A 2等位基因頻率分布差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表2。

2.4 GUCY1A3基因位點rs7692387的基因型與冠心病患病風險評估

將研究對象作為整體進行分析，以GUCY1A3基因位點rs7692387的基因型（GG=1，GA+AA=2）、年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、吸煙史、收縮壓、舒張壓作為自變量，有無冠心病（有=1，無=0）作為因變量建立Logistic回歸模型。結果顯示，排除可能與冠心病有關的一些混雜因素后，GUCY1A3基因位點rs7692387的GG基因型與GA+AA基因型比較，其可增加冠心病的患病風險2.327，P=0.039），表明GG基因型可能是冠心病發病的易感基因型。見表3。

圖1 GUCY1A3基因位點rs7692387的基因型測序結果

表2 GUCY1A3基因位點rs7692387基因型頻率及等位基因頻率分布比較

表3 GUCY1A3基因位點rs7692387的基因型與冠心病的Logistic回歸分析

2.5 GUCY1A3基因位點rs7692387的等位基因與冠心病患病風險評估

將研究對象作為整體進行分析，以GUCY1A3基因位點rs7692387 的等位基因（A=1，G=2）、年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、吸煙史、收縮壓、舒張壓作為自變量，有無冠心病（有=1，無=0）作為因變量建立Logistic回歸模型。結果顯示，排除可能與冠心病有關的一些混雜因素后，GUCY1A3基因位點rs7692387的A等位基因與G等位基因比較，其可降低冠心病的患病風險表明A等位基因可能是冠心病的保護性基因。見表4。

表4 GUCY1A3基因位點rs7692387的等位基因與冠心病的Logistic回歸分析

3 討論

冠心病是嚴重影響人類健康和生活質量的心血管疾病之一，其發病率和死亡率逐年上升，如今已成為我國城鄉居民疾病死亡的首要原因[6]。冠心病是1種多基因疾病，遺傳因素對其發生和發展有影響，該基因的多態性和冠心病之間的關系是目前研究的主要方向。基因多態性反映基因的選擇性表達，是人類基因組在抵御不良環境影響過程中的1種適應性表現，包括SNP、DNA重復序列多態性以及DNA片段長度多態性，在疾病易感性和人體對疾病的抵抗力等方面發揮重要作用[7]。SNP是基因多態性中最常見的1種，已被列為對復雜性疾病產生影響的最主要因素之一[8]。已有研究證實，單個或多個基因的遺傳易感性會對CAD的發病產生直接影響，且不同地域、種族或同種族不同地域人口的CAD易感性具有差異[9]。全基因組關聯分析檢測到GUCY1A3基因座常見的非編碼區突變與CAD之間具有很強的關聯性[10]。GUCY1A3基因是編碼sGC的α1亞基，sGC是NO-sGC-cGMP信號轉導通路中的關鍵酶，大部分以α1/β1異二聚體的形式廣泛分布于許多實質臟器及各種組織細胞中[11]。當體內的sGC被NO激活，激活的sGC可以將GTP轉化為cGMP，后者則作為細胞內調節信息的傳遞者，介導舒張血管、降低血壓及促進Na+排泄等正常生理活動[12]。動物實驗研究也證明，若將大鼠的sGCα1、α2或sGCβ1基因敲除，其血管平滑肌舒張、血壓調節及血小板聚集等方面的功能均會較正常對照組產生不同程度的紊亂，部分會發生嚴重疾病，甚至死亡[13]。與之類似，心血管系統疾病患者體內的NO-sGC-cGMP信號通路也常為紊亂狀態，其根本原因是NO在病理狀態下被清除，導致通路中最重要的第二信使cGMP無法被正常激活，從而不能發揮其正常生理功能[14]。綜上，NO-sGC-cGMP通路在心血管疾病的發生和發展過程中顯得尤為重要，其將成為多種心血管系統疾病（如冠心病、心肌梗死、心力衰竭和慢性肺心病等）有效治療靶標[15]。

本研究結果顯示，入選的研究對象基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明所收集的樣本基本能代表延邊地區漢族人群GUCY1A3基因多態性分布。本研究中冠心病組GG基因型頻率高于對照組，而對照組GA+AA基因型頻率高于冠心病組，有差異。應用Logistic回歸分析排除年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、吸煙史、收縮壓、舒張壓該混雜因素的作用后，有差異，與基因型為GA+AA者比較，基因型為GG者其患CAD的危險性增加，表明GG基因型很可能是延邊地區漢族人群冠心病發病的易感基因型。GUCY1A3基因位點rs7692387的A等位基因頻率分布在對照組中高于CAD組，而G等位基因頻率分布在CAD組中高于對照組，有差異。應用Logistic回歸分析排除年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、吸煙史、收縮壓及舒張壓該混雜因素的影響后，有差異，與攜帶G等位基因比較，攜帶A等位基因可降低冠心病的患病風險，表明A等位基因可能是延邊地區漢族人群冠心病的保護性基因。

本研究在一定程度上為冠心病易感人群的篩選及保護提供理論依據，從而根據不同個體的基因多態性實施針對性的早期干預，對冠心病的預防及個性化治療具有重要意義。同時由于國內外對GUCY1A3基因位點rs7692387的研究較少，該試驗的結果仍需在擴大樣本含量的基礎上，對不同種族、不同地域的人群進行更加深入的研究。

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