蘆薈苦素對黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞混合培養(yǎng)模型中黑素合成的影響

[摘要]目的：體外構(gòu)建黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞直接接觸的混合培養(yǎng)模型，觀察蘆薈苦素、熊果苷及茶多酚對此模型中黑素細(xì)胞的影響。方法：以包皮組織作為細(xì)胞來源，分別培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞；體外構(gòu)建黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞直接接觸的混合培養(yǎng)模型，檢測蘆薈苦素、熊果苷及茶多酚作用于此模型后對黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性以及黑素合成的影響。結(jié)果：黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞混合培養(yǎng)5天后出現(xiàn)淺灰色，繼續(xù)培養(yǎng)，顏色逐漸加深。三種退色劑對酪氨酸酶活性及黑素的合成均呈濃度依賴性抑制。結(jié)論：成功構(gòu)建了黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞直接接觸的混合培養(yǎng)模型，三種退色劑均對黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性及黑素合成產(chǎn)生濃度依賴性抑制，以茶多酚作用最強(qiáng)，蘆薈苦素次之。

[關(guān)鍵詞]混合培養(yǎng)模型；黑素細(xì)胞；角質(zhì)形成細(xì)胞；蘆薈苦素；熊果苷；茶多酚

[中圖分類號]Q343.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)03－0310-03

黑素是決定皮膚顏色的最主要因素，生理情況下角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)通過分泌一些生長因子或細(xì)胞外基質(zhì)成分，直接或間接地對黑素細(xì)胞形態(tài)、黑素合成和轉(zhuǎn)運(yùn)等活動進(jìn)行調(diào)節(jié)。酪氨酸酶是黑素合成的主要限速酶，催化酪氨酸羥化為多巴并進(jìn)而形成多巴醌的反應(yīng)，該酶的活性大小決定著黑素合成的數(shù)量。由于酪氨酸酶在黑素合成中的重要作用，許多退色劑通過抑制酪氨酸酶活性，從而減少黑素的形成。本實(shí)驗(yàn)以兒童包皮為組織來源分離培養(yǎng)的黑素細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞來構(gòu)建黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞直接接觸的混合培養(yǎng)模型，模擬體內(nèi)“表皮黑素單元”的結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上，研究了蘆薈苦素、熊果苷與茶多酚對黑素細(xì)胞(MC)的影響。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 標(biāo)本：取自包皮環(huán)切術(shù)切除的包皮組織(兒童：7～10歲)。

1．1．2 主要試劑與儀器：蘆薈苦素(aloesin)購自深圳市榮格生物化學(xué)制品有限公司；熊果苷(arbutin)購自北京貝麗萊日用化工廠；茶多酚(TP)購自安徽紅星藥業(yè)有限責(zé)任公司；霍亂毒素(CT)、左旋多巴(L－Dopa)、Dispase酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白購自美國Sigma公司；堿性成纖維細(xì)胞生長因(bFGF)購自珠海億勝生物制藥公司；重組人表皮生長因子(EGF)購自深圳市華生元基因工程發(fā)展有限公司；小鼠抗人細(xì)胞角蛋白單抗AE1/AE3、SP奧抗試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中山。高通量多功能微板測試系統(tǒng)Biotrak-2英國Amersham。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞的混合培養(yǎng)模型的建立：鼠尾膠原溶液的制備參照文獻(xiàn)。以KGM－G7F培養(yǎng)液(DMEM/F12(3:1)，10％(v/v)胎牛血清，腺嘌呤0.18mM，EGF10ng/ml，氫化可的松0.4μg/ml，胰島素5μg/ml，異丙腎上腺素10μM，轉(zhuǎn)鐵蛋白5μg/ml，三碘甲狀腺原氨酸2nM，氨芐青霉素100μg/ml，硫酸鏈霉素100μg/ml培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞；收集真皮，剪碎，采用組織塊法培養(yǎng)以獲得成纖維細(xì)胞。向生長接近80％融合的成纖維細(xì)胞中加入絲裂霉素，最終濃度為10μg/ml，在孵箱中孵育4h，用無鈣鎂PBS洗2次，加入0.25％的胰酶消化、離心、重懸后計(jì)數(shù)，以1.0×10⁴/ml接種于已預(yù)鋪膠原的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)液為DMEM+15％小牛血清，隔日使用。

取生長狀態(tài)良好的黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞，常規(guī)消化、離心，細(xì)胞記數(shù)后以KGM－G7F培養(yǎng)液重懸，將兩種細(xì)胞懸液混合，調(diào)整角質(zhì)形成細(xì)胞濃度為1.0×10⁵/ml、黑素細(xì)胞濃度為0.3×10⁵/ml。將24孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液吸棄，每孔加入細(xì)胞懸液1ml，于50ml/L CO₂37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每2天換液一次，同時倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞接種后的生長狀況。

1．2．2 藥物處理與實(shí)驗(yàn)分組：藥物溶液根據(jù)根據(jù)文獻(xiàn)的方法方法配制實(shí)驗(yàn)藥物分為蘆薈苦素、熊果苷、茶多酚共三大組，對照組以PEH代替，吸棄上清液，每孔加入KGM－G7F 900μl及藥物溶液100μl每組藥物最終濃度分別為1，0.1，0.01 g/L，每一濃度6個孔。對照組每孔加KGM－G7F 900μl和100μl100ml/L PEH共6個孔。

1．2．3 酪氨酸酶活性測定：參見文獻(xiàn)的方法。酪氨酸酶活性抑制率=(1－各濃度平均吸光度值÷對照組平均吸光度值)×100％。

1．2．4 黑素含量測定：黑素含量采用NaOH方法測定：藥物作用一周后，三種藥物各濃度及對照組均取3孔，棄上清液，0.01mol/L的PBS洗2次，每孔加入1ml 1mol/L的NaOH，震蕩5 min，每孔中的原液吸取200μl分別加入96孔板的兩孔之中，選擇405nm波長在高通量多功能微板測試系統(tǒng)上測吸光度值。黑素合成抑制率=[(對照組吸光度值－藥物組吸光度值)÷對照組吸光度值]×100％。

1．2．5 統(tǒng)計(jì)分析：所測數(shù)據(jù)采用SPSS11.0，NoSA2.3統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析處理。

2 結(jié)果

2．1 黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞混合培養(yǎng)：黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞混合培養(yǎng)后，在培養(yǎng)的過程中逐漸出現(xiàn)顏色變化，培養(yǎng)的第五天培養(yǎng)板中的培養(yǎng)物逐漸變成淺灰色，隨著培養(yǎng)時間的延長，顏色逐漸加深。

2．2 黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響：蘆薈苦素對酪氨酸酶活性呈濃度依賴性抑制；熊果苷對酪氨酸酶活性也呈濃度依賴性抑制，但抑制作用弱于蘆薈苦素；茶多酚在各濃度都有非常強(qiáng)的抑制作用，抑制作用強(qiáng)于蘆薈苦素和熊果苷(P＜0.05)。表1。

2．3 對黑素細(xì)胞黑素合成的影響：蘆薈苦素、熊果苷及茶多酚對黑素合成有抑制作用，以茶多酚的抑制作用最強(qiáng)，蘆薈苦素次之(P＜0.05)；在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。表2。

3 討論

自1982年Eisinger和Marko體外培養(yǎng)皮膚MC成功以來，人們對退色劑的研究進(jìn)入了快速發(fā)展的階段。然而這種黑素細(xì)胞的單獨(dú)培養(yǎng)未考慮體內(nèi)其它鄰近細(xì)胞對黑素細(xì)胞的影響，并且培養(yǎng)的黑素細(xì)胞的生物學(xué)行為很大程度上依賴于一系列細(xì)胞因子的作用，與體內(nèi)環(huán)境有很大的差異，使得試驗(yàn)結(jié)果的參考價值受到一定的限制。1988年Halaban首次成功地建立黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞在MCDB－153、DMEM、TIP三種培養(yǎng)基中的共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MC與KC能在MCDB－153培養(yǎng)基中存活超過14天，Mc的樹突延伸至相鄰的KC；而MC單獨(dú)培養(yǎng)于MCDB－153時不能貼壁，7天后失去活性。這說明混合培養(yǎng)降低了對培養(yǎng)基的要求，細(xì)胞間的相互接觸以及分泌的細(xì)胞因子維持了細(xì)胞的生長。Valyi－Nagy等將MC和KC共培養(yǎng)于不同的情況下：①M(fèi)C和KC用微孔多聚碳酸酯膜隔開；②單層細(xì)胞混合培養(yǎng)。結(jié)果，在第一種情況下，MC的樹突保持雙極和三級，在KC培養(yǎng)基中不能增值；當(dāng)MC和未分化的KC建立細(xì)胞間連接后，MC和KC以相似的速度分裂增值，并發(fā)展為多級的樹突狀，直接接觸的混合培養(yǎng)方式中黑素細(xì)胞的形態(tài)較間接接觸的細(xì)胞形態(tài)接近在體內(nèi)的形態(tài)。這說明直接接觸的混合培養(yǎng)方式更有利于體外對黑素細(xì)胞的研究。

在培養(yǎng)的過程中，24孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)物逐漸呈現(xiàn)淺灰色，顏色逐漸加深。這表明混合培養(yǎng)的過程中黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞相互刺激，促進(jìn)了黑素小體由黑素細(xì)胞向角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)。在培養(yǎng)的第三天加入退色劑，此時黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞剛剛建立接觸，尚未發(fā)生黑素小體的大規(guī)模移行，對實(shí)驗(yàn)藥物的檢測比較靈敏。本試驗(yàn)加入退色劑后的檢測結(jié)果表明：①蘆薈苦素對酪氨酸酶活性呈濃度都依賴性抑制；熊果苷對酪氨酸酶活性也呈濃度依賴性抑制，但抑制作用弱于蘆薈苦素；茶多酚在各濃度有非常強(qiáng)的抑制作用，抑制作用強(qiáng)于蘆薈苦素和熊果苷(P＜0.05)。②蘆薈苦素、熊果苷及茶多酚對黑素合成有抑制作用，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。三種退色劑對黑素細(xì)胞的影響與濃度成正相關(guān)，以茶多酚對細(xì)胞的影響最大，毒性最強(qiáng)；蘆薈苦素次之，與我們前期結(jié)果一致。

以色素化皮膚類似物為模型來篩選退色劑，雖然黑素細(xì)胞所處的環(huán)境更接近體內(nèi)，但由于構(gòu)建色素化皮膚類似物操作復(fù)雜，用于精確篩選某幾種退色劑還是比較合適的，用它來大規(guī)模地篩選退色劑則受到了一定程度的限制。而黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞混合培養(yǎng)模型的構(gòu)建所需時間短，操作相對簡單，又考慮了對黑素細(xì)胞有重要影響的角質(zhì)形成細(xì)胞的作用，能夠在一個類似生理環(huán)境的系統(tǒng)中研究MC和KC的相互作用以及探索退色劑的作用機(jī)制，雖然試驗(yàn)結(jié)果與臨床有一定的差距，但基本上滿足了大規(guī)模地初步篩選退色劑的要求。在本實(shí)驗(yàn)中蘆薈苦素所表現(xiàn)出的較好的退色效果，值得我們進(jìn)一步在色素化皮膚類似物和動物模型中驗(yàn)證和推廣，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。