貴紫麥1號籽粒色素形成相關基因的差異表達

徐熙，任明見，李魯華，楊喜翠，徐如宏

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貴紫麥1號籽粒色素形成相關基因的差異表達

徐熙，任明見，李魯華，楊喜翠，徐如宏

（貴州大學農學院/國家小麥改良中心貴州分中心， 貴陽 550025）

【目的】探明貴紫麥1號小麥灌漿期變紫后和變紫前2個時期籽粒的轉錄組差異，發掘影響貴紫麥1號花青素合成的關鍵基因和關鍵酶，豐富小麥籽粒色素轉錄組數據信息，為轉錄因子的克隆及表達提供參考。【方法】利用Illumina Hiseq 2000TM高通量測序技術對貴紫麥1號籽粒變紫前和變紫后2個時期進行轉錄組測序、文庫構建及建庫質量評估，對測序結果進行信息學分析。采用TTM對read count數據進行標準化處理，隨后用DEGseq進行差異分析，設定-value＜0.005且|log2(fold change)|＞1為閾值。通過篩選分析，獲得兩者間差異表達基因，按照無參轉錄組分析方法，對差異表達基因進行BLAST搜索，Nr數據庫比對，GO功能富集及KEGG pathway分析，找出與花青素相關的關鍵基因和關鍵酶，并結合qRT-PCR驗證所找到的關鍵基因及關鍵酶在不同時期的表達水平，掌握這些關鍵基因的信息。【結果】測序結果表明，貴紫麥1號變紫后和變紫前分別獲得13.36 G和12.69 G的clean bases，clean reads為106 906 108條和101 547 534條，占原始序列的93.73%和94.90%。通過Trinity軟件對所得clean reads進行拼接，共獲得170 396條轉錄本，長度為119 020 625。拼接clean reads后獲得119 572條Unigenes。在BLAST搜索中，119 572個高質量獨特序列中有86 004條（71.92%）Unigenes與現有基因模型具有至少1個顯著匹配。在Nr數據庫比對結果鑒定了至少5種具有與來自節節麥、烏拉爾圖小麥、二穗短柄草、大麥、小麥等已知基因同一性且序列相似性高的Unigenes。KOG數據庫比對結果顯示，注釋成功的基因按KOG的26個group進行分類，注釋在一般功能基因，蛋白質翻譯后修飾與轉運、分子伴侶及翻譯、核糖體結構與生物合成等類別基因所占比重較大，分別為15.79%、14.51%和10.54%。643個差異基因中，236個呈上調趨勢，407個呈下調趨勢。GO注釋表明，按照基因參與的生物過程、所處的細胞組分、具有的分子功能下一層級分類，共44個分類，差異基因顯著富集在碳水化合物代謝過程（GO:0005975，16.03%）、應激反應(GO:0006950，10.83%)和水解酶活性分子功能(GO:0016787，34.84%)等類別中。KEGG pathway富集分析可知，353個差異基因富集到153條相關通路上，其中淀粉與蔗糖代謝、苯丙素生物合成、類黃酮生物合成等通路富集顯著。類黃酮生物合成途徑相關基因共66個，2條相關上調表達Unigenes，涉及查爾酮酶、隱色花色素雙加氧酶2個關鍵酶基因，log2(fold change)分別為3.4164和2.1258。對所得關鍵基因進行qRT-PCR驗證，證實查爾酮酶、隱色花色素雙加氧酶在貴紫麥中1號中表達量呈明顯上調趨勢，與轉錄組測序分析結果一致，測序結果可靠度高。【結論】比較分析貴紫麥1號籽粒變紫后和變紫前2個時期轉錄組測序結果，獲得大量Unigenes數據及差異表達基因相關信息，明確類黃酮代謝途徑中2個關鍵酶基因（和）在調控貴紫麥1號籽粒花青素合成過程中作用顯著。

貴紫麥1號；籽粒；灌漿期；花青素；轉錄組；高通量測序

0 引言

【研究意義】紫色小麥是一種特殊的小麥種質，其籽粒呈現出的紫色與紫色種皮中的黃酮類化合物花青苷有關，而花青苷由花青素和糖基結合而成[1]，花青素在許多植物中起重要作用，不僅作為防止UV-B照射的保護劑，還表現出抗氧化活性，因此具有在人類健康中用作潛在的抗癌和抗動脈硬化化合物的功能。此外，花青素構成生物活性代謝物，還參與調節植物與昆蟲，哺乳動物和鳥類等的種間關系[2-3]。國家小麥改良中心貴州分中心于2004年用自育品系貴紫99-4小麥作母本，與自育品系貴農03-7作父本雜交后，采用系譜法于2010年選育得到小麥品系貴紫麥1號，并于2015年6月經貴州品種審定委員會通過品種審定，審定編號為黔審麥2015003號。貴紫麥1號籽粒不僅整粒為紫色，而且在產量、品質、抗病性（白粉病、條銹病、赤霉病等）、抗旱耐寒、耐瘠薄等方面均表現出較強的優勢，同時與其他一些紫黑色小麥相比，其含有豐富的蛋白質、維生素和多種微量元素。分析貴紫麥1號小麥籽粒花青素合成的關鍵基因和關鍵酶，探尋其花青素代謝合成途徑，可為小麥籽粒色素相關基因的鑒定、功能分析以及特異性表達研究提供參考。【前人研究進展】國內外學者對小麥紫色籽粒的研究大多從遺傳性狀入手，由于不同品種小麥遺傳背景不同，得出的結論也有差異。徐丙元等[4]確定漯珍一號的紫粒受到分別位于2A和3A染色體的2個獨立基因的控制，且多酚氧化酶活性最高；Dobrovolskaya等[5]認為Purple Feed和Purple與Saratovskaya雜交后的紫粒受2對互補的顯性基因控制；黃碧光[6]以C75與紫粒小麥03初3為材料，認為紫粒呈2對顯性互補基因控制的母性遺傳；宗學鳳等[7]認為參與促進花青素的合成；李杏普等[8]認為多酚氧化酶活性影響小麥籽粒顏色，與小麥抗病性相關。除遺傳性狀外，環境因子和調控因子對花青素的合成代謝皆有影響。低溫誘導相關基因表達，高溫加劇植物分解代謝，影響酶活性，從而影響花青素的穩定性及含量[9-12]。強光誘導結構基因及調節基因的表達，調節轉錄因子表達模式，提高花青素累積量[13-14]，不同光質調控相應光受體的表達，影響花青素的合成量[15]。植物激素如茉莉酸、赤霉素、脫落酸等可在花青素的合成途徑中誘導或調控相關基因的表達[1,16-18]。前人對小麥紫色籽粒的研究大多從籽粒品質、發育形態和脅迫機制等方面入手，而在籽粒顏色形成的差異表達研究方面少見有報道，僅在其他一些作物上有相關研究，如周姚[19]發現水稻中調控突變后，可影響花青素的合成；Bovy等[20]將玉米中的轉錄因子轉入番茄中，類黃酮總量提高，但不影響花青素的含量；Li等[21]將轉入水稻品種chao2-10中，雖然花青素含量明顯提高，但會引起水稻不育；張長青等[22]以越橘為試材，發現等酶基因在越橘幼果和/或成熟果中上調。【本研究切入點】通過對貴紫麥1號籽粒的初步橫切和縱切觀察，發現其中具有果皮、種皮、糊粉層均為紫色的籽粒。近年來，人們愈加重視紫色小麥的營養價值及生理生化指標，但對紫色小麥顏色相關的調控基因研究尚未完全明確。【擬解決的關鍵問題】對貴紫麥1號同株籽粒變紫前和變紫后2個灌漿時期的轉錄組測序，進行差異表達分析，對所找到的差異表達基因進行注釋，并在富集和代謝中找到調控花青素合成的相關基因，進一步揭示紫色小麥顏色相關的基因調控途徑，為貴紫麥1號在小麥育種研究中的應用打下分子基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

貴紫麥1號種植于貴州大學教學實驗場國家小麥改良中心貴州分中心科研基地（26o23′N，106o40′E，海拔1 121 m），每小區面積30 m2，長×寬=6 m×5 m，小麥播幅33 cm，采用隨機區組實驗設計，每小區重復3次。田間管理澆水、除草和施肥等按統一方式進行。貴紫麥1號2016年4月6日左右抽穗，于4月10日開花期選取開花一致的麥穗進行掛牌標記并連續觀察記載。本次試驗以開花后12日籽粒未變紫作為變紫前的樣品，以開花后25日整個籽粒2/3變紫作為變紫后的樣品（圖1），每日各取不同植株的3個麥穗籽粒進行樣品混合，液氮速凍后置于-80℃超低溫冰箱保存，用于總RNA提取和轉錄組測序。

1：變紫前before purple-changing；2：變紫后After purple-changing

1.2 RNA提取及總RNA純度與完整性檢查

采用天根RNAsimple植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA污染情況。使用Nanodrop分光光度計檢測樣品OD260/230值，繼而對RNA進行純度分析；Agitent2100生物分析儀檢測樣品濃度、RIN值以及28s/18s值。

1.3 文庫構建及測序

將樣品送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行建庫測序，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物Mrna，隨后加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機引物（random hexamers）合成一鏈cDNA，加入緩沖液、dNTPs、DNA polymerase I和RNase H合成二鏈cDNA，AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA先進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，再用AMPure XP beads進行片段大小選擇。最后進行PCR擴增，并用AMPure XP beads純化PCR產物，得到最終的文庫。庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求pooling后進行Illumina HiSeq測序。

1.4 原始數據過濾及轉錄本拼接

原始數據過濾流程如下：（1）去除帶接頭（adapter）的reads；（2）去除N（N表示無法確定堿基信息）比例＞10%的reads；（3）去除低質量reads。為了保證信息分析質量，需對raw reads過濾，得到clean reads，后續分析都基于clean reads結果。由于貴紫麥1號轉錄組為無參轉錄組，獲得clean reads后，諾禾致源采用Trinity對clean reads進行拼接，以獲取后續分析的參考序列[23-24]。

1.5 差異基因表達篩選分析

基因差異表達的輸入數據為基因表達水平分析中得到的read count數據。首先采用TMM對read count數據進行標準化處理，再用DEGseq進行差異分析，篩選閾值-value＜0.005且|log2(fold change)| ＞1。對于差異基因，如果基因的log2(fold change) ＞0，則認為該差異基因為上調，反之，若log2(fold change) ＜0，認為該差異基因為下調[25]。

1.6 差異基因GO功能注釋、分類及KEGG分析

本研究對于GO富集分析方法為GOseq，該法基于Wallenius non-central hyper-geometric distribution。首先將所有差異表達基因Gene Ontology數據庫與各個term 映射，計算每個term的基因數目，隨后與整個基因組背景相比，在差異表達基因中顯著富集[26]。

KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）是有關Pathway的主要公共數據庫。Pathway顯著性富集分析以KEGG Pathway為單位，應用超幾何檢驗，找出差異基因相對于所有有注釋的基因顯著富集的pathway。使用KOBAS（2.0），設置參數--fdr為BH（即使用BH校正）進行Pathway富集分析。FDR≤0.05的Pathway，即定義為在差異表達基因中顯著富集的Pathway[27]。

1.7 差異表達基因熒光定量PCR（qRT-PCR）驗證

以-作為內參基因，待驗證基因為和，特異性引物序列見表1。使用TransScript II All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（北京全式金）試劑盒對1.2中提取的模板RNA進行逆轉錄，SYBRGreen染料法進行qRT-PCR，每個樣品3次重復。差異倍數采用2-△△Ct法進行計算。

表1 用于熒光定量PCR驗證的基因及引物

2 結果

2.1 測序產量統計及轉錄本拼接

利用高通量測序技術，對貴紫麥1號籽粒灌漿期變紫前和變紫后2個時期進行轉錄本測序（表2）。貴紫麥1號籽粒變紫后獲得原始序列片段114 058 286條，篩選過濾后，獲得106 906 108條clean reads，占原始序列的93.73%。貴紫麥1號籽粒變紫前獲得原始序列片段數量為107 009 534條，篩選過濾后，獲得101 547 534條clean reads，占原始序列的94.90%。結果顯示2個轉錄組文庫測序質量較好，準確度高，滿足后續數據分析需求。

表2 測序數據評估統計

WS1：變紫后after purple-changing；WS2：變紫前before purple-changing

通過Trinity軟件對所得clean reads進行拼接，整合并取每條基因中最長的轉錄本作為Unigene，共獲得170 396條轉錄本，長度為119 020 625。貴紫麥1號clean reads獲得119 572條70 339 868長的Unigenes。平均長度為588 bp，長度為200—500 bp的Unigenes數量最多占總數的66.44%。Unigenes N50和N90長度分別為869和250 bp。

2.2 貴紫麥1號轉錄組基因功能注釋

為獲得全面的基因功能信息，對獲得的119 572條Unigenes進行了Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss- prot、KEGG、GO 7大數據庫的基因注釋。119 572個高質量獨特序列中，在BLAST搜索中，有86 004條（71.92%）Unigenes與現有基因模型具有至少1個顯著匹配。通過將本研究中發現的DEG與NCBI數據庫進行比較，鑒定了至少5種具有與來自節節麥（Aegilops tauschii）、烏拉爾圖小麥（Triticum urartu）、大麥（Hordeum vulgare）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、小麥（Triticum aestivum）已知基因同一性且序列相似性高的Unigenes（圖2）。

2.3 KOG轉錄因子注釋

將組裝得到的20 255條Unigenes在KOG數據庫進行比對，KOG分為26個group，將注釋成功的基因按KOG進行分類，轉錄因子注釋結果表明一般功能基因，蛋白質翻譯后修飾與轉運、分子伴侶以及翻譯、核糖體結構與生物合成所占比例較大，分別為15.79%、14.51%和10.54%（圖3）。

圖2 Nr庫比對上的物種分布和相似度分布圖

功能定義；數目Functional definition; Number。A：RNA加工與修飾RNA processing and modification (954)；B：染色質結構與變化Chromatin structure and dynamics (256)；C：能量產生與轉化Energy production and conversion (1605)；D：細胞周期調控與分裂、染色體重排Cell cycle control, cell division and chromosome rearrangement (523)；E：氨基酸運輸代謝Amino acid transport and metabolism (1058)；F：核苷酸轉運和代謝Nucleotide transport and metabolism (319)；G：碳水化合物轉運和代謝Carbohydrate transport and metabolism (1010)；H：輔酶運輸和代謝Coenzyme transport and metabolism (274)；I：脂類運輸與代謝Lipid transport and metabolism (1044)；J：翻譯、核糖體結構與生物合成Translation, ribosomal structure and biosynthesis (2134)；K：轉錄Transcription (901)；L：復制、重組與修復Replication, recombination and repair (438)；M：胞壁/膜生物發生Cell wall/membrane biogenesis (187)；N：細胞運動Cell motility (9)；O：蛋白質翻譯后修飾與轉運、分子伴侶Posttranslational modification and transport, molecular chaperones (2939)；P：無機離子運輸與代謝Inorganic ion transport and metabolism (502)；Q：次生產物合成、運輸及代謝Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism (916)；R：一般功能基因Generally functional genes (3199)；S：功能未知Function unknown (723)；T：信號傳導機制Signal transduction mechanisms (1517)；U：胞內分泌與膜泡運輸Intracellular trafficking and vesicular transport (1179)；V：防御機制Defense mechanisms (159)；W：細胞外結構Extracellular structures (48)；X：未命名的蛋白質Unnamed protein (2)；Y：核酸結構Nuclear structure (80)；Z：細胞骨架Cytoskeleton (524)

2.4 RNA-seq整體質量評估

樣品間基因表達水平相關性是檢驗試驗可靠性和樣本選擇是否合理的重要指標，使用R語言進行Pearson相關系數計算后發現，2個材料相似系數為0.601，說明整體質量較好。

2.5 差異基因分析

通過將貴紫麥1號變紫前和變紫后2個時期轉錄組進行比較，并將存在差異表達的基因進行統計分析發現，共找到差異表達基因643個，其中上調基因236個，下調基因407個，分別占差異基因數量的36.7%、63.3%（圖4）。

WS1：變紫后after purple-changing；WS2：變紫前before purple- changing

2.6 GO注釋及富集

Gene Ontology（基因本位，GO）是全面描述生物體中基因及其產物的屬性的分類系統。對獲得的基因進行GO注釋之后，按照基因參與的生物過程（biological process）、所處的細胞組分（cellular component）及具有的分子功能（molecular function）的下一層級進行分類GO注釋，結果顯示（圖5）共44個分類。注釋成功的39 906條基因中基因參與的生物過程有19組下級分類，大部分注釋在代謝過程（GO：0008152，21 253條）、細胞過程（GO：0009987，20 960條）及單生物過程（GO：0044699，15 921條）。其次與所處的細胞組分有關，共14組下級分類，注釋較多的分別是細胞（GO：0005623，11 749條）和細胞部分（GO：004464，11 739條）。最少的是與具有的分子功能有關的差異表達基因，共11組下級分類，20 953和17 973條基因被注釋在結合（GO：0005488）和催化活性（GO：0003824）類別下。在DAG圖上將不同富集程度的GO標上不同的顏色，可清楚地展示研究的生物學意義（圖6）。GO注釋的433個差異基因富集在生物過程和分子功能上，從富集情況來看，富集在生物過程的差異基因較為顯著的有碳水化合物代謝過程（GO：0005975，16.03%）、應激反應（GO：0006950，10.83%）、防御反應（GO：0006952，7.32%）等，富集在分子功能的差異基因主要有水解酶活性分子功能（GO：0016787，34.84%），酯鍵（GO：0016788，11.53%）、肽酶活性（GO：0008233，9.41%）。

2.7 差異基因KEGG分析

類黃酮生物合成代謝途徑（ko00941）共66個相關的基因（表3），排在上調差異基因富集前20的通路中（圖7）。KO00941含有2條相關的上調差異Unigenes。矯正后的-value為0.6577，基因ID為c61642_g2、c57850_g1，涉及ANS[EC：1.14.11.19 ]和CHS[EC：2.3.1.74 ]，log2(fold change)分別為3.4164和2.1258。由通路可知，貴紫麥1號合成的花青素主要為天竺葵色素、矢車菊色素和飛燕草色素（圖8）。

2.8 差異表達基因的qRT-PCR驗證

為驗證基因差異表達的可靠性，選取（c61642_g2）、（c57850_g1）2個目的基因進行qRT-PCR驗證（圖9）。結果發現隨著籽粒變紫，目的基因表達水平變化趨勢相同均表現上調，表明通過轉錄組測序技術分析出的差異基因結果真實可靠。

3 討論

本研究利用轉錄組測序技術，對貴紫麥1號同株麥粒變紫前和變紫后2個灌漿時期的轉錄組測序獲得大量數據。將存在的差異表達基因進行統計分析，結果表明2個材料存在大量的差異基因，下調基因多于上調基因，這些上調或下調基因導致不同灌漿時期差異表現。通過將得到的差異基因與NCBI數據庫進行比對，至少鑒定了5種與來自節節麥、烏拉圖爾小麥、大麥、二穗短柄草和普通小麥的已知基因同一性且序列相似性高的unigenes。將組裝得到的Unigenes在KOG數據庫比對后，得到26個group。GO注釋結果表明，注釋成功的基因按照參與的生物過程、所處的細胞組分及具有的分子功能的下一層級進行分類注釋，共44個分類。433個差異基因富集較為顯著的有碳水化合物代謝過程、應激反應、防御反應、水解酶活性分子功能等，這與前人在水稻[28-29]、玉米籽粒[30]轉錄組得到的結果一致，說明在小麥灌漿期間，大量相關調控基因參與到生物過程與分子過程中，影響著小麥生長發育和相關酶催化調節的相互作用，推測這些富集顯著的差異基因是調控小麥灌漿過程中的關鍵基因。由KEGG注釋結果來看，353個差異基因富集在碳代謝、氨基糖等代謝通路，富集在淀粉、蔗糖、苯丙素代謝通路上的基因呈下調趨勢，這與李懷珠[31]所研究的籽粒發育形態建成時期前期的結果相反，但同時印證了在灌漿后期，儲存物質合成已大致完成，調控形態建成的差異基因開始大量表達。

橫坐標為GO 3個大類的下一層級的GO term，縱坐標為注釋到該term下（包括該term的子term）的基因個數。紅色表示生物過程、藍色表示細胞組分、綠色表示分子功能The abscissa is the GO term of the next level belongs to three major categories of GO and the ordinate is the number of genes annotated to the term (including the sub-term of the term). Red indicates biological process, blue indicates cellular component, green indicates molecular function

‘—’：未在NR庫中找到描述The description not found in the NR library；NA：無法計算結果Unable to calculate the result

每個方框或圓圈代表一個GO term，方框中內容從上到下代表的含義依次為GO term的id、GO的描述、GO富集的corrected-value、該GO下差異基因的數目/該GO下背景基因的數目

Each box or circle represents a GO term, the contents of the box from top to bottom on behalf of the meaning of id to GO term, GO description, GO enriched corrected-value, the number of differential genes/the number of background genes under the GO

圖6 topGO有向無環圖

Fig. 6 Directed acyclic graph of topGO

圖7 KEGG通路富集程度散點圖

圖8 KEGG數據庫中類黃酮生物合成途徑

圖9 差異表達基因qRT-PCR與RNA-seq結果對比

小麥籽粒的類黃酮生物合成代謝途徑共66個相關基因，排在上調差異基因顯著性的前20個通路之中，2條相關的上調差異Unigenes皆富集在生物學途徑的分子功能上，經過轉錄組測序結果分析及qRT-PCR驗證分析表明，類黃酮代謝途徑中，呈明顯上調趨勢，推測在貴紫麥1號灌漿期間，由于這些生物合成酶的大量上調，導致在較短時間內籽粒顏色迅速變紫。由KEGG通路可知，貴紫麥1號合成的花青素主要為天竺葵色素、矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥素和錦葵色素，這與趙善倉等[32]測定紫繁3小麥含有矢車菊色素的結果一致，但紫繁3含有的芍藥素、錦葵色素在貴紫麥1號中為天竺葵色素、矢車菊色素和燕草色素的次生代謝產物。

催化4-香豆酸CoA與丙二酰CoA合成查爾酮，形成的查爾酮提供基本碳骨架。在貴紫麥1號中處于花青素合成的第二階段，合成矢車菊色素的前體物質，調控花青素的合成。由于是花青素早期合成階段重要的調控基因，依賴轉錄因子合成類黃酮，在后續研究中，可通過導入反義或敲除，從不同材料中獲得其他有色或無色的小麥品種，也可利用貴紫麥1號為橋梁親本，通過雜交、回交轉育，結合分子輔助選擇，將與紫色控制相關基因轉移到其他普通主栽小麥品種中，培育出適合不同生態型、品質優良、高產的特色小麥品種，從而提高紫色小麥的利用價值，促進特色小麥產業化發展。

的表達具有一定的組織特異性且受外界環境因素的影響[33]。在貴紫麥1號中的表達使果皮、種皮、糊粉層皆呈紫色，這也印證了在水稻突變體中，過表達使原花青素前體物在果皮中生成花青素，而玉米突變體中，的表達使花青素產生于糊粉層之中[34]。據研究轉錄因子對具有正、負調控的作用，且同類的轉錄因子在不同植物中對調控作用也不同[35]。由于在貴紫麥1號中呈上調表達，推測在小麥中對起正調控的作用。符思路[36]鑒定的23個小麥Unigene中，13個小麥轉錄因子在擬南芥中存在同源基因，其他基因在小麥中發生擴增，沒有發現小麥特有基因，但鑒定的組織僅為幼苗、根、花藥小穗等小麥生育前期組織，并未涉及籽粒灌漿時期。Nesi等[37]發現矮牽牛和玉米與擬南芥較為相似，但與中的轉錄因子都可激活，卻在花青素的生物合成中體現抑制性，因此認為調控基因的調控框架與調控子的等級有一定的相關性，不能單靠同源性預測，貴紫麥1號是否具有特異基因還需進一步驗證。分析黃酮類KEGG通路時發現，在合成異甘草素的代謝途徑中，和在共同調控異甘草素的合成，呈明顯上調趨勢，既不上調也不下調。研究表明，是病毒感染時誘導抗病毒應激顆粒的細胞漿體生產的關鍵因素[38]，尹祥佳[39]將以農桿菌介導玉米莖尖中進行遺傳轉化，結果呈陽性且部分植株結實。如果敲除或導入，觀察貴紫麥1號中異黃酮生物合成和抗病性表現，或許可進一步明確在小麥中的作用。

4 結論

通過對貴紫麥1號籽粒2個灌漿時期轉錄組測序及分析，獲得66個類黃酮生物合成代謝途徑相關基因在貴紫麥1號中的表達信息，發現236個上調差異基因，407個下調差異基因。在調控花青素形成過程中具有關鍵作用。

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（責任編輯 岳梅）

Differential expression of grain pigment related genes of Guizimai No.1

Xu Xi, Ren MingJian, Li LuHua, Yang XiCui, Xu RuHong

(College of Agriculture, Guizhou University/Guizhou Sub-center of National Wheat Improvement Center, Guiyang 550025)

【Objective】 The objective of this study is to investigate the transcriptome differences after and before purple- changing periods of grain at filling stage of Guizimai No.1, explore the key genes and enzymes that contribute to the biogenesis of anthocyanin, and then enrich the transcriptome data of grain pigment in wheat, provide references for the cloning and expression of the transcription factor. 【Method】 RNA-seq, construction library and quality assessment were carried out for two periods before and after purple-changing of Guizimai No.1 by using the Illumina Hiseq 2000TMsequencing platform, and the sequencing results was analyzed by bioinformatics. TTM was used to standardize the read count data, then DEGseq was used to analyze the difference, and the-value＜0.005 and | log2(fold change) |＞1 were set as the threshold. The differential expression genes (DEGs) were obtained through selecting, in accordance with the transcriptome sequencing, then these DEGs were analyzed by BLAST search, NR annotated, GO functional enrichment and KEGG pathway method to find out the key genes and enzymes associated with anthocyanins, and combined qRT-PCR to verify the expression level of the key genes and key enzymes in different periods, finally the information of these key genes was mastered. 【Result】 The RNA-seq results showed that 13.36 G and 12.69 G clean bases were obtained, 106 906 108 and 101 547 534 clean reads accounted for 93.73% and 94.90% of the raw reads after and before purple-changing of Guizimai No.1, respectively. Clean reads were spliced by Trinity, totally 170 396 transcripts were obtained with a length of 119 020 625. There were 119 572 Unigenes after splicing clean reads. In the BLAST search, 86 004 (71.92%) Unigenes out of 119 572 high quality unique sequences had at least one significant match to existing gene models. According to Unigenes’ Nr database alignment, at least 5 Unigenes with similar gene identities and known sequence homologies to,,,,, and so on were identified. The results of KOG database alignment showed that the annotated genes were classified according to 26 groups in KOG, and the greater percentage of generally functional genes, posttranslational modification and transport, molecular chaperones and translation, ribosomal structure and biosynthesis was 15.79%, 14.51% and 10.54%, respectively. A total of 643 DEGs were found, 236 DEGs were up-regulated and 407 DEGs were down-regulated. GO commentary indicated that there were 44 terms in accordance with biological process, cellular component, molecular function of the next level of classification, the differential genes significantly enriched in the carbohydrate metabolism process (GO: 0005975, 16.03%), stress response (GO: 0006950, 10.83%) and hydrolase activity (GO: 0016787, 34.84%) and other categories. KEGG pathway enrichment analysis showed that the 353 different genes were enriched in 153 related pathways, among them, the pathways of starch and sucrose metabolism, phenylpropanoid biosynthesis and flavonoid biosynthesis were significantly enriched. There were 66 genes related to flavonoid biosynthesis, and two up-regulated Unigenes, involving two key enzyme genes of,. log2(fold change) were 3.4164 and 2.1258, respectively. The qRT-PCR results showed that the expression ofandafter purple-changing was significantly up-regulated, which was consistent with the results of RNA-Seq analysis, RNA-seq results were reliable. 【Conclusion】Compared the RNA-seq after and before purple-changing periods of Guizimai No.1 grain, a large number of Unigenes and DEGs were obtained. It is identified that the two key enzyme genes (and) in flavonoid metabolism pathway play a significant role in the regulation of anthocyanin synthesis in Guizimai No 1.

Guizimai No.1; grain; filling stage; anthocyanin; transcriptome; Illumina sequencing

2017-08-15；

2017-11-10

國家自然科學基金（31660390）、貴州省農業成果轉化計劃（黔科合成果（2016）4022號）、國家“七大農作物育種”重點專項（2017YFD0100900）、貴州省作物學省級重點學科建設計劃（黔學位合字ZDXK[2014]8號）、貴州省普通高等學校糧油作物遺傳改良與生理生態特色重點實驗室項目（黔教合KY字[2015]333）

徐熙，E-mail：xuxigz@163.com。

徐如宏，E-mail：xrhgz@163.com