食管癌“環境-遺傳-基因互作”組學研究：核黃素、核黃素轉運基因2和NOTCH1-P53-Rb互作關系

王立東，杜丹鳳，宋 昕，趙學科，胡守佳，周福有，毛偉敏，李秀敏

1)鄭州大學第一附屬醫院河南省食管癌重點開放實驗室 鄭州 450052 2)鄭州大學基礎醫學院病理學教研室 鄭州 450001 3)安陽市腫瘤醫院胸外科 河南安陽 455000 4)浙江省腫瘤醫院胸外科 杭州 310022 5)新鄉醫學院癌癥研究中心 河南新鄉 453003

本研究組利用全基因組關聯分析和全基因組外顯子測序技術發現核黃素轉運基因2(riboflavin transporter gene 2, RFT2；又稱C20orf54、SLC52A2、RFVT3)是食管鱗狀細胞癌(簡稱鱗癌)重要易感基因[1]，NOTCH1基因突變是食管癌變的重要分子事件[2]。這些發現引發學者對RFT2和NOTCH1與腫瘤發生和發展的關系進行深入研究。最新研究[3]發現：RFT2不僅是一個重要的易感基因，可能還是一個重要的致病基因；由于核黃素缺乏而引發的RFT2變化和RFT2變異而引起的核黃素利用障礙等又進一步誘導食管癌變多階段演進密切相關的NOTCH1和P53-Rb通路發生改變[2,4]。這些分子變化不但揭示“環境(核黃素)-遺傳(RFT2)-基因(NOTCH1-P53-Rb)互作”模式對闡明食管癌變分子機制的理論意義，同時也為食管癌高危人群分子分型，并進一步建立針對中國人、符合國情的規范化高危人群預警篩查及個體化防治指南提供重要理論依據和技術支撐。本文就這一領域最新進展，特別是“環境(核黃素)-遺傳(RFT2)-基因(NOTCH1-P53-Rb)互作”變化關系做簡要闡述。

1 核黃素缺乏與食管鱗癌

顯著的地域性分布差異(高、低發區發病率相差500倍)和明顯家族聚集現象(家族史陽性患者占40%)是中國人食管癌顯著的流行病學特征，提示環境和遺傳因素在食管癌發生中的重要性。我國老一代科學家對河南、河北和山西三省交界的太行山食管癌高發區人群研究[5-13]發現：維生素缺乏(特別是核黃素、維生素A和葉酸等)和亞硝胺暴露是中國人食管鱗癌發生的主要因素。核黃素是一種水溶性維生素，又稱維生素B2，是黃酶類輔基的重要組成部分。在生物氧化還原中，黃酶起傳遞氫離子的重要作用。核黃素的重要生物學激活形式有2種，即黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)和黃素單核苷酸(flavin mononucleotide，FMN)(圖1)[14]。

圖1 核黃素分子結構圖

核黃素不能自身合成，只能依賴膳食補充。核黃素在各類食品中廣泛存在，但通常動物性食品和綠葉蔬菜及豆類含量較多。有關核黃素與食管癌關系的重要發現包括以下幾方面。①食管癌高發區人群研究：食管癌高發區人群核黃素缺乏明顯，特別值得指出的是，高發區15～26歲人群也出現明顯的核黃素缺乏[13]，且核黃素缺乏的人群食管癌前病變發生率明顯升高[6-7,10,15-16]。將核黃素加到食鹽中(俗稱黃鹽)，可作為膳食核黃素補充的重要方法。在食管癌高發區河南的林州、河北的磁縣和四川的鹽亭地區進行數十年干預研究發現，長期膳食補充核黃素能夠降低食管癌前病變和癌的發生率[9,17-26]，這一現象也見于其他國家食管癌高發區[15-16,27-28]。②食管癌與癌旁正常組織：食管癌組織核黃素水平明顯低于正常組織[29-30]，核黃素缺乏能明顯增加食管癌復發和預后差的風險[31]。③動物模型和細胞系：核黃素缺乏大鼠經甲基芐基亞硝胺處理后，食管癌發生率顯著高于核黃素正常組；食管癌細胞系能夠重復驗證高發區人群的觀察結果：用喂飼食管癌高發區四川鹽亭居民飲食的大鼠血清處理人食管癌細胞系，發現可明顯促進細胞增殖，并能明顯誘導CyclinD1和CDK4蛋白及mRNA高表達，而P16和Rb呈現低表達，補充包括核黃素的復合維生素能夠逆轉上述改變[32-33]。綜上，核黃素缺乏是食管癌發生的重要危險因素。

2 RFT2與食管鱗癌發生風險

2.1核黃素轉運基因的分類和命名[14]人核黃素轉運基因家族目前克隆有3種基因類型，即核黃素轉運基因1、RFT2和核黃素轉運基因3，分別定位于染色體17p13.3、20p13和8q24.3。這3種跨膜轉運基因與目前已知的溶質載體家族(solute carrier family，SLC)成員均不相同，2017年12月被命名為SLC新成員，并分別命名為SCL52A1(核黃素轉運基因1)、SCL52A2(RFT2)和SCL52A3(核黃素轉運基因3)(詳見http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/113278)。核黃素轉運基因1和RFT2基因序列和功能相似。而自2010年首次發現RFT2與食管鱗癌高發病風險相關以來，有關RFT2與腫瘤關系的研究受到廣泛關注。

2.2RFT2與食管鱗癌發生風險[14]RFT2又稱 BVVLS、RFVT3、hRFT2、BVVLS1、C20orf54、bA371L19.1、SLC52A2，包含5個外顯子，編碼51 000跨膜蛋白(含469個氨基酸)，主要負責核黃素跨膜轉運。Wang等[1]對2.5萬例中國漢族食管鱗癌和對照人群全基因組的關聯分析和驗證發現2個中國人群食管鱗癌重要易感位點，即rs2274223和rs13042395。這2個位點分別定位于10q23的PLCE1基因和20p13的C20orf54基因。進一步的驗證發現這2個SNP位點也明顯與中國少數民族食管癌高發區新疆哈薩克族和維吾爾族人群食管鱗癌高風險密切相關，同時還與賁門腺癌高風險相關。經基因庫檢索發現，C20orf54就是RFT2，從而揭示了老一代科學家發現的核黃素缺乏與食管癌發生關系的分子機制，也不同程度解釋了核黃素補充干預存在明顯個體差異現象的分子基礎。作為食管癌高風險遺傳標簽，RFT2基因rs13042395位點發生的SNP變異已被應用到食管癌高危人群預警和篩查中，明顯提高了早期癌的發現率。

2.3RFT2最新研究進展①癌組織RFT2全基因組測序發現10個突變位點，主要集中在第3外顯子(5個)，其次是第5外顯子(2個)和第2外顯子(2個)，第1外顯子發生1個突變位點。同時還發現高、低發區癌組織突變類型不同，這一結果提示RFT2不僅是一個重要的易感基因，同時還是一個重要的致病基因，不同的環境因素可能在RFT2突變中起重要作用[2]。②癌組織分析發現RFT2存在2種不同類型的蛋白表達，分別為469個和415個氨基酸，并據此將RFT2蛋白分類為RFT2a(469個氨基酸)和RFT2b(415個氨基酸)。很顯然，進一步了解這2種不同的蛋白類型對食管癌發生發展的影響將有助于加深對RFT2功能的了解。③RFT2基因rs13042395 SNP位點CC基因型的食管癌患者生存期明顯差于CT基因型，提示RFT2基因型也是一個重要的預后指標。④食管癌組織中RFT2明顯高表達；敲除或降低食管癌細胞系RFT2蛋白表達能明顯降低四羥酮醇或黃素(核黃素的激活狀態)水平和線粒體膜電位及細胞ATP水平，抑制細胞增殖、克隆形成和浸潤；敲除RFT2可明顯降低P21和P27蛋白表達，進一步導致其下游CyclinE1和CDK2蛋白表達以及pRb低磷酸化，最終導致細胞停滯在G1～G1/S期；此外還發現，敲除RFT2能夠降低抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl和Survivin的表達；與此相反，食管癌細胞系RFT2過表達顯現出對化療藥物順鉑的抗性，可以抵抗順鉑誘導的細胞凋亡[34]。⑤喂飼食管癌高發區四川鹽亭居民飲食(低核黃素)的大鼠血清處理人食管癌細胞系明顯促進細胞增殖，并能明顯誘導CyclinD1和CDK4蛋白及mRNA高表達，而P16和Rb呈現低表達，補充包括核黃素的復合維生素能夠逆轉這些改變[32]。⑥RFT2變異明顯提高胃癌和腦膠質瘤發病風險[35-36]。

綜上，RFT2基因既是一個重要的易感基因，同時也是一個重要的致病基因；RFT2通過維持核黃素內穩態及能量代謝等支持腫瘤細胞的快速惡性增殖并逃逸細胞凋亡，在食管癌發生發展過程中起重要作用；RFT2基因還與作者以前發現的食管癌變過程中P53-Rb通路頻發改變的多個基因(cyclinE1、cdk2、bcl-2、bcl-xl、survivin、p21、p27、p16、Rb、cyclinD1、cdk4等)相關，提示環境-遺傳-基因互作在食管癌發生中起重要作用。這些研究結果為食管癌高危人群分子分型的界定及個體化防治提供了重要的技術支撐。現將核黃素缺乏(環境因素)、RFT2基因多態(遺傳因素)與食管癌變多階段演進P53-Rb通路分子變化(環境-基因互作)關系總結于圖2。

圖2 RFT2-NOTCH1-P53-Rb 互作關系

3 展望

目前尚無規范化食管癌高危人群預警篩查早期發現和防治指南。建立高危人群客觀評價標準是實施食管癌精準防治的關鍵。傳統上，高發區、40歲以上、男性、吸煙飲酒、家族史陽性的無癥狀人群被籠統界定為“高危或高風險人群”，也是早期食管癌主要篩查對象。由于色素內鏡和活檢病理及內鏡下治療技術的快速推廣應用，傳統的食管拉網脫落細胞學早期發現篩查手段已完全被色素內鏡所取代。但是，需要特別指出的是，內鏡檢查需要經驗、復雜的設備和程序，并且微創和不適，特別是高成本和低效率，不容易被大眾接受。例如，常規高發區內鏡篩查上述“高危人群”，早期癌的發現率僅2%左右，癌前病變10%左右，約90%的無癥狀“高危人群”均為“陪伴檢查”等，這些局限性限制了內鏡在無癥狀高危人群食管癌預警篩查和早期發現中的推廣應用。

因此，基于“環境-遺傳-基因互作”食管癌變機制的新模式，建立界定高危人群的分子分型標準，確定用于預警篩查、早期發現、早期診斷和個體化防治的分子靶標，利用一滴血檢測這些分子標簽，確定高危人群，然后對這些高危人群進行色素內鏡和活檢病理檢查，將極大提高早期癌和癌前病變患者的檢出率，從而為最終降低食管癌發病率和死亡率提供重要技術支撐。本研究組利用這一思路，對食管癌高發區無癥狀1.1萬例居民進行外周血易感基因位點、自身抗體等檢測，確定660例高危人群，然后對這些高危人群進行色素內鏡和黏膜活檢，發現234例食管癌患者，較傳統無癥狀人群內鏡篩查早期癌2%的發現率提高了近18倍，作者據此提出食管癌高危人群預警篩查和早期發現的思路(圖3)。越來越多的研究結果正在不斷豐富“環境-遺傳-基因互作”食管癌變機制的新模式，這些研究將為進一步建立食管癌高危人群預警篩查、早期發現和防治提供重要理論和技術支撐。

圖3 食管癌高危人群預警篩查和早期發現思路圖

致謝：非常感謝澹會芳、韓少華、樊冰雨、李孟祥在論文撰寫過程中給予的幫助。

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