DZNep對裸鼠食管鱗癌移植瘤生長的抑制作用

張 樂，李慶華，楊 璐，朱立強，張彥婷，關方霞

1)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001 2)鄭州大學第二附屬醫院檢驗科 鄭州 450014

食管鱗癌是發展中國家的主要食管癌類型，在世界范圍的食管癌患者中約占95%，全球每年新增約50萬例食管癌患者，其中一半以上發生在中國，尤其是河南、河北和山西三省交界的太行山區[1]。目前，化學治療仍是食管癌常規治療的主要方法之一。但是，長期使用化療藥物往往會造成腫瘤細胞的耐藥性。DZNep最初被認為是通過抑制S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)活性來抑制S-腺苷-甲硫氨酸依賴的甲基化反應，最近的研究[2]發現它能通過抑制組蛋白甲基轉移酶 EZH2誘導腫瘤細胞的凋亡。EZH2可以特異性地使組蛋白H3的第27位點的賴氨酸(H3K27)三甲基化(H3K27me3)，從而使下游靶基因沉默。近年來，EZH2被認為是一種致癌基因，EZH2過表達與腫瘤的發生和發展密切相關[3-4]。因此，DZNep作為EZH2的小分子抑制劑，因其對腫瘤潛在的治療作用而受到關注[5-9]。前期研究[10]發現，DZNep能抑制食管鱗癌細胞Eca109的增殖，促進其凋亡。為了進一步探究DZNep對食管鱗癌的治療作用，作者觀察了DZNep對裸鼠食管鱗癌移植瘤生長的抑制作用，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞株與試劑食管鱗癌細胞株Eca109購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，DZNep購自美國Selleck公司，5-氟尿嘧啶(5-FU)購自美國Sigma公司，標準胎牛血清(FBS)購自天津灝洋生物制品有限公司，胰蛋白酶及RPMI 1640培養基均購自美國 HyClone 公司，Caspase-3、內參GAPDH多克隆抗體及組織蛋白提取試劑盒均購自上海生工生物技術服務有限公司，E-cadherin、SAHH多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司，H3K27me3、總組蛋白和PTEN等抗體購自美國 Cell Signaling Technology 公司。TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司。

1.2細胞培養與裸鼠飼養Eca109細胞培養于含體積分數10% FBS的RPMI 1640培養基中，置于含體積分數5% CO2的培養箱內37 ℃培養，每隔1 d傳代1次。BALB/c裸鼠，6周齡，雄性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，體重25～30 g，飼養于河南省實驗動物中心，飼養條件達到SPF級。

1.3裸鼠移植瘤模型的建立及實驗分組15只新購裸鼠在適應7 d后開始進行實驗，取對數生長期Eca109細胞接種于裸鼠右側背部皮下，每只裸鼠接種 200 μL細胞懸液(3×107mL-1)，10 d后將裸鼠采用隨機數字表法分為3組，每組5只。對照組：腹腔注射生理鹽水，隔天注射1次，持續2周；DZNep組：按照1 mg/kg腹腔注射DZNep，隔天注射1次，持續2周；5-FU組：按照5 mg/kg腹腔注射5-FU，隔天注射1次，持續2周。藥物處理后開始隔天測量腫瘤的長徑和短徑，計算腫瘤的體積。第13天測量完畢后處死裸鼠，取出腫瘤并稱量。

1.4Westernblot法檢測腫瘤組織中mTOR/p70S6K信號通路相關蛋白、黏附因子、總組蛋白的表達情況將收集的腫瘤組織標本按試劑盒說明書提取總蛋白，定量后SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白分離，采用濕轉法將目的蛋白轉至PVDF膜上，封閉2 h后加入一抗(SAHH、EZH2、E-cadherin、Caspase-3、H3K27me3、總組蛋白、PTEN、mTOR、p-p70S6K)，4 ℃孵育過夜，然后在二抗溶液中孵育1 h，清洗后加入ECL超敏發光液進行化學發光顯色，結果使用Image J進行分析。

1.5TUNEL法測定腫瘤細胞的凋亡情況裸鼠腫瘤組織石蠟包埋、切片，經脫蠟、促滲、通透、封閉后按照說明書進行操作。200倍顯微鏡下觀察，棕色為凋亡細胞。細胞凋亡率=(凋亡細胞數/腫瘤細胞總數)×100%。

1.6統計學處理采用SPSS 21.0進行數據分析。不同組間裸鼠瘤塊體積的比較采用重復測量數據的方差分析；不同組間裸鼠腫瘤塊質量、細胞凋亡率、黏附因子、總組蛋白、mTOR/p70S6K信號通路相關蛋白表達的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1DZNep對Eca109細胞在各組裸鼠體內增殖的影響15只裸鼠均荷瘤成功，成瘤率100%，腫瘤生長情況見圖1和表1、2。可以看出，與對照組相比，從處理后第7 天開始5-FU組與DZNep組瘤塊體積減小。

mm3

F組間=8.643，P=0.007；F時間=14.776，P<0.001；F交互=13.024，P<0.001；*：與對照組相比，P<0.05

表2 各組裸鼠腫瘤塊質量比較 g

F=26.770,P<0.001;*：與對照組相比，P<0.05

2.2DZNep對腫瘤組織中EZH2和SAHH蛋白表達的影響結果顯示，與對照組和5-FU組相比， DZNep組EZH2蛋白表達降低(圖2、表3)。

圖2 各組裸鼠腫瘤 組織中EZH2和SAHH蛋白的表達

組別nEZH2SAHHCaspase?3E?cadherinH3K27me3總組蛋白PTENmTORp?p70S6K對照組50．60±0．110．88±0．200．56±0．040．56±0．030．83±0．040．53±0．110．36±0．150．66±0．091．17±0．085?FU組50．67±0．12#0．90±0．100．91±0．02?0．78±0．02?0．86±0．10#0．55±0．100．43±0．11?#0．61±0．05?#1．06±0．05?#DZNep組50．32±0．11?0．86±0．110．92±0．10?0．72±0．02?0．50±0．12?0．56±0．040．82±0．14?0．30±0．09?0．70±0．11?F171．9804．910112．67061．980139．2704．630161．770126．71019．510P<0．0010．055<0．001<0．001<0．0010．061<0．001<0．0010．002

*：與對照組相比，P<0.05;#:與DZNep組相比，P<0.05

2.3DZNep對腫瘤組織中細胞凋亡、黏附蛋白表達的影響結果見圖3、4和表3、4。可以看出，與對照組比較，DZNep組和5-FU組Caspase-3表達水平升高，細胞凋亡率增加，黏附蛋白E-cadherin表達水平升高。

圖3 各組裸鼠腫瘤組織中Caspase-3、E-cadherin蛋白的表達

A：對照組；B：5-FU組；C：DZNep組圖4 各組裸鼠腫瘤組織中細胞凋亡的檢測結果(TUNEL，×200)

F=65.570,P<0.001;*：與對照組相比，P<0.05

2.4DZNep對腫瘤組織中m-TOR/p70S6K信號通路相關蛋白表達的影響結果見圖5、表3。可以看出，與對照組和5-FU組相比，DZNep組中總組蛋白表達不變，H3K27me3表達下降，PTEN表達增加，m-TOR和p-p70S6K表達降低。

圖5 各組裸鼠腫瘤組織中 mTOR/p70S6K信號通路相關蛋白的表達

3 討論

多年來，手術、放化療等食管癌的治療方法取得了巨大的進展，但其術后5 a總體生存率不足20%，因此尋找食管鱗癌有效的靶向治療成為研究熱點。EZH2是組氨酸-賴氨酸-N-甲基轉移酶，在多種腫瘤組織中異常高表達，它可以使多個抑癌基因表達沉默，其中包括促凋亡基因及抑制細胞增殖的基因，從而促進腫瘤的生長[11-12]。該研究使用EZH2抑制劑DZNep對Eca109荷瘤裸鼠進行治療，結果顯示，DZNep能顯著抑制腫瘤組織中EZH2蛋白的表達，從而抑制了其對H3K27的甲基化作用。前期研究[13]發現，DZNep能有效抑制食管鱗癌細胞Eca109的增殖，促進其凋亡。該研究進一步證實DZNep能有效抑制食管鱗癌細胞的生長，增強其黏附性，并促進其凋亡，DZNep與5-FU有相當的效果。

雷帕霉素靶蛋白信號通路在腫瘤發生發展中起重要作用。研究[14]發現，mTOR/p70S6K信號通路在食管鱗癌細胞中異常激活。PTEN位于mTOR/p70S6K信號通路的上游，它能通過磷酸化PIP3，負性調節mTOR/p70S6K信號通路。還有研究[15]發現，在食管鱗癌組織中PTEN甲基化，從而導致PTEN蛋白的低表達。該研究發現，DZNep能促進PTEN表達，抑制mTOR和p70S6K表達，說明DZNep能通過促進PTEN的表達而抑制mTOR/p70S6K信號通路活性。

綜上所述，DZNep可能是通過抑制EZH2來抑制mTOR/p70S6K信號通路，從而抑制食管鱗癌細胞生長。該研究結果提示，DZNep可能成為靶向抑制EZH2的食管鱗癌的治療藥物。

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