缺氧下神經生長因子受體p75在膀胱癌細胞中表達的變化及生物學特點

樊長暉，許長寶，趙興華，郝 斌，吳國清

鄭州大學第二附屬醫院泌尿外科 鄭州 450014

神經生長因子受體p75(nerve growth factor receptor p75，p75 NGFR)是神經生長因子跨膜糖蛋白受體，它在眾多腫瘤組織中的表達及其功能都有報道。在不同腫瘤組織中執行的功能不同，在乳腺癌中具有促進腫瘤生長和抗凋亡作用，而在胃癌及膀胱癌中有抑癌基因作用。缺氧是實體瘤的重要特點，是導致腫瘤惡性轉化的重要微環境。為進一步了解缺氧環境下膀胱癌細胞的表面蛋白及基因表達變化以及膀胱癌細胞的生物學特性，本課題研究了缺氧條件下p75 NGFR在不同分化的膀胱癌細胞系上的表達變化，缺氧條件下膀胱癌細胞的凋亡以及對化療藥物的敏感性等生物學特性，為臨床尋找控制膀胱癌侵襲轉移以及抗藥性新靶點提供理論支持。

1 材料與方法

1.1材料膀胱鱗癌細胞株SCaBER和中分化的移行細胞癌細胞株5637購于中科院上海細胞所。鼠抗人p75 NGFR單克隆抗體購自Biosource公司，HRP標記羊抗鼠IgG、SP免疫細胞化學染色試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京中杉公司。兩步法RT-PCR試劑盒購于上海生工生物工程有限公司。

1.2缺氧條件下的細胞培養將不同膀胱癌組織來源的鱗癌細胞株SCaBER和中分化的移行細胞癌細胞株5637分別置于正常氧濃度條件下(37 ℃、體積分數5% CO2、體積分數21% O2和體積分數74% N2)和缺氧(37 ℃、體積分數5% CO2、體積分數10% O2和體積分數85% N2)環境中培養。實驗分別收集了SCaBER和5637在正常氧濃度條件下和缺氧條件下24、48和72 h的細胞進行檢測。

1.3 2種細胞中p75NGFR蛋白的表達取對數生長期的膀胱癌細胞，用0.2 g/L EDTA消化后，1 500 r/min離心5 min，棄上清。用PBS重懸細胞，1 500 r/min離心5 min，棄上清。制成單細胞懸液，移至EP管中，調整細胞濃度為1×106mL-1。取細胞懸液100 μL，加鼠抗人p75NGFR單克隆抗體5 μL，4 ℃避光孵育30 min，用PBS洗滌細胞3次。各加入兔抗鼠熒光標記的抗體IgG 5 μL，置室溫1 h，用PBS洗滌細胞3次。另取細胞懸液100 μL，直接加入兔抗鼠熒光標記的抗體IgG 5 μL，置室溫1 h，用PBS洗滌細胞3次，作為對照。流式細胞儀檢測p75 NGFR蛋白的熒光標記率。每種細胞均設6個平行對照。

1.4 2種細胞中p75NGFRmRNA表達的RT-PCR檢測收集SCaBER和5637在正常氧濃度條件下和缺氧條件下培養24、48、72 h的腫瘤細胞，分別提細胞的總RNA。各取等量RNA，進行RT-PCR。用AMV反轉錄酶進行反轉錄，得到總cDNA，然后以之為模板進行PCR。PCR反應體系為50 μL，其中無菌雙蒸水25.8 μL，10×Buffer 5 μL， MgCl23 μL，dNTP 5 μL，p75 NGFR上、下游引物各2.0 μL，β-actin上、下游引物各1.0 μL，逆轉錄混合液5.0 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL。PCR 擴增條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR 產物采用凝膠圖像掃描儀拍照并進行條帶灰度分析，以p75NGFR/β-actin灰度值的比值代表其相對含量。

1.5不同培養條件下2種細胞凋亡的流式細胞儀檢測膀胱癌細胞暴露于缺氧環境 1、3、5、7 d，以常氧培養組作為對照組。收集不同條件下培養的膀胱癌細胞后4 ℃預冷，PBS洗2次，調整細胞密度約(0.5～1)×106mL-1，取100 μL細胞懸液，1 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄上清，200 μL冰預冷1×Binding Buffer重懸細胞，將試管置于冰上，加5 mL Annexin V-FITC和10 μL PI到100 μL的細胞懸液中，輕輕混勻；用對照細胞另設未染色管、單染Annexin V-FITC管及單染PI管；將樣品輕輕渦旋，將試管置于冰上，室溫避光孵育10 min；加入400 μL 1×Binding Buffer，輕輕混勻，在30 min內用波長為488 nm的單發射激光檢測FITC，分析結果。以未染色細胞調零機器，以Annexin V-FITC單染管和PI單染管為基準參照，測定每個上樣管數據，利用Cell Quest 3.0軟件進行參數獲取和資料分析，計算細胞凋亡率。

1.6不同培養條件下絲裂霉素(MMC)對2種細胞抑制率影響的MTT法檢測取不同培養條件下的膀胱癌細胞，計數并調整細胞密度為5×104mL-1接種于96孔板，每孔150 μL細胞懸液，過夜貼壁，加入臨床用藥密度MMC。分別繼續培養24、48和72 h后，每組細胞加入5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續培養4 h；小心吸棄培養上清液，加入200 μL DMSO，室溫下振蕩10 min使紫色結晶全部溶解，在96孔酶標儀上以空白對照孔調零，酶聯免疫檢測儀上于492 nm波長檢測各孔吸光度值。各實驗孔吸光度值減去空白對照孔吸光度值得出其A值，間接反映存活細胞數量。按下面公式計算不同條件下的膀胱癌細胞的活力。細胞生長抑制率=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.7統計學方法采用SPSS 23.0進行分析。應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比不同培養條件下2種膀胱癌細胞中p75 NGFR蛋白和mRNA表達的差異，應用2×2析因設計的方差分析比較不同培養條件下2種膀胱腫瘤細胞中凋亡率的變化和不同培養條件下MMC對2種膀胱癌細胞抑制率的影響。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1不同培養條件下2種膀胱癌細胞中p75NGFR蛋白的陽性表達率比較見圖1、表1。細胞表面p75NGFR蛋白陽性表達為細胞膜呈綠色熒光。熒光顯微鏡下可清楚觀察到，與常規培養的對照組相比，在缺氧環境中培養72 h后，膀胱癌細胞表面p75 NGFR蛋白均發生抑制，效應熒光強度也隨之減弱。在2個細胞系缺氧24、48 h p75 NGFR蛋白表達陽性率有所下降，但與常氧組相比差異無統計學意義；在72 h與其余各組相比差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2不同培養條件下2種膀胱癌細胞中p75NGFRmRNA的表達見圖2、表2。瓊脂糖凝膠電泳顯示2個細胞系p75 NGFR在mRNA水平都有表達。2個細胞系p75 NGFR mRNA在缺氧24、48 h表達下降，但與常氧組相比差異無統計學意義；在72 h與其余各組相比，mRNA表達差異有統計學意義(P<0.05)。

上排：5637細胞；下排：SCaBER細胞；左：常氧；右：缺氧72 h圖1 不同培養條件下2種膀胱癌 細胞中p75 NGFR 蛋白表達的免疫熒光染色結果

*：與其余各時間點相比，P<0.05

1：DNA Marker；2～5：分別為常氧、缺氧24、48、72 h；上排：5637細胞；下排：SCaBER細胞圖2 不同培養條件下 2種膀胱癌細胞中p75 NGFR mRNA的表達

組別SCaBER細胞5637細胞常氧組1．50±0．071．01±0．06缺氧24h組1．45±0．050．96±0．03缺氧48h組1．40±0．050．92±0．05缺氧72h組0．85±0．06?0．58±0．06?F83．65251．496P<0．001<0．001

*：與其余各時間點相比，P<0.05

2.3不同培養條件下2種膀胱癌細胞凋亡的檢測結果見表3。

表3 不同培養條件下2種膀胱腫瘤細胞中凋亡率的變化(n=6) %

2.4不同培養條件下MMC對2種膀胱癌細胞抑制率的影響見表4。

表4 不同培養條件下MMC對 2種膀胱癌細胞抑制率的影響(n=6) %

3 討論

p75 NGFR屬于神經生長因子低親和的受體。有研究[1]表明p75 NGFR在許多腫瘤組織中都有表達，其在惡性腫瘤中不僅可促進腫瘤細胞的生長、增殖、轉移，也可抑制腫瘤，誘導腫瘤細胞的凋亡，起到雙重調節的作用。Li等[2]發現p75 NGFR與食管癌的分期及淋巴細胞的轉移有關；有學者[3]研究認為，p75 NGFR是膀胱癌和前列腺癌轉移的抑制基因，認為p75 NGFR對腫瘤的抑制是通過抑制細胞增殖和促進凋亡實現的。有學者[4]認為p75 NGFR與腫瘤壞死因子受體蛋白超家族的結構和序列具有同源性，屬于腫瘤壞死因子受體超家族，有細胞內死亡結構域，可以連結相應的信號通路引發細胞凋亡。p75 NGFR的表達可有選擇地影響細胞周期調節成分，以至于延遲了細胞從G1期進入到有絲分裂的S期[5]。

研究[6]發現，實體瘤與其周圍的組織相比氧分壓是降低的，并且認為缺氧是腫瘤發生惡性轉化甚至轉移的啟動因子，目前發現在許多膀胱癌組織中氧含量較低。有研究[7]報道，膀胱癌中缺氧可以誘發血管增生和缺氧誘導因子-1的表達增加，而這些可以引起腫瘤的浸潤增加和復發。Ord等[8]對膀胱癌研究發現，腫瘤的壞死率隨膀胱癌分期的增加而增加。有學者[9]認為如果能夠對缺氧細胞進行治療有可能提高腫瘤的局部控制和患者的長期生存率。探討腫瘤細胞在缺氧過程中細胞生物學特性的變化，對研究腫瘤惡變及侵襲和轉移的機制有重要意義。本研究在體外模擬缺氧環境，觀察膀胱癌細胞在缺氧環境下表面蛋白的表達變化，進一步研究p75 NGFR在膀胱癌侵襲轉移以及治療抵抗上的作用提供理論依據。

本實驗結果顯示p75 NGFR在不同分化來源的膀胱癌細胞上均有表達，并且在缺氧條件下p75 NGFR蛋白表達陽性率及mRNA在2個細胞系隨著缺氧時間的延長表達均呈逐漸下降趨勢。免疫熒光染色也證實膀胱癌細胞表面p75 NGFR蛋白在缺氧環境中培養72 h后均發生抑制效應，熒光強度也隨之減弱。從實驗結果可以看出，在缺氧環境下不同分化的膀胱癌細胞從表面蛋白及內在的RNA水平均有變化。缺氧環境下膀胱癌細胞的凋亡結果顯示，膀胱癌細胞SCaBER、5637在缺氧第3天開始凋亡率低于對照組，差異有統計學意義。本研究結果與目前報道的缺氧抑制腫瘤細胞的凋亡相一致[10]。膀胱癌藥物敏感試驗顯示缺氧環境下MMC對膀胱癌細胞SCaBER和5637的抑制率低于常氧組，隨著時間延長差異越明顯，說明缺氧條件下膀胱癌細胞對化療藥物的敏感性下降。

綜上所述，缺氧條件下膀胱癌細胞的凋亡及對化療藥物的敏感性發生變化，說明缺氧可以導致膀胱癌的生物學特性發生改變，這與膀胱癌的惡性度的變化以及侵襲和轉移之間有無關聯需要進一步研究。

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