尖銳濕疣組織中Bad和增殖細胞核抗原蛋白表達的檢測

夏仙仙，蔡丙杰，沙 珂，潘信心，尹光文

鄭州大學第一附屬醫(yī)院皮膚科 鄭州 450052

1 對象與方法

1.1研究對象CA標本均來自2015年9月至2016年9月鄭州大學第一附屬醫(yī)院皮膚科門診，患者臨床表現典型，醋酸白實驗為陽性，皮損經組織病理證實為CA，原位雜交證明HPV感染存在，均與CA的診斷標準相符合，且無其他系統(tǒng)性疾病；皮損取材前患者均未接受免疫性的藥物、冷凍、激光等任何相關治療；共收集53例CA患者組織標本，其中男32例，女21例；年齡16～65(32.5±8.7)歲；病程14～180(50.7±4.3) d。28例對照組標本均來自同期本院泌尿科成年男性包皮環(huán)切術后所切除的包皮組織，并經組織病理查證實其為正常組織上皮。

1.2試劑與方法所有實驗組織標本經40 g/L多聚甲醛固定，石蠟包埋，并連續(xù)作0.4 μm厚度切片，然后將其覆于用多聚賴氨酸處理過的玻片上，置于60 ℃烤箱烘烤4 h以上備用。兔抗人Bad多克隆抗體(濃縮型)購自武漢Proteintech公司，兔抗人PCNA多克隆抗體(濃縮型)購自Abcam公司，SP-9001試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司。采用免疫組化SP法檢測所有標本中Bad和PCNA蛋白的表達情況。所有實驗操作步驟都按試劑盒上的說明進行。在相同條件，所有切片染色，且每批染色均設陽性對照、陰性對照。用已知染色陽性的組織切片為陽性對照，陰性對照以PBS代替一抗孵育組織切片。

1.3結果判斷Bad蛋白陽性表達主要處于細胞膜和細胞質，陽性顯色為棕黃色至棕褐色顆粒。PCNA蛋白陽性表達定位于細胞核，棕黃色或棕褐色顆粒為陽性染色。參照文獻[1]評分標準，根據組織切片中染色強弱及陽性細胞所占總細胞百分比進行分級評分。染色強度分為不著色、淺黃色、棕黃色及棕褐色，分別對應著0分、1分、2分和3分；陽性細胞占總細胞的百分比≤10%：0分，11%～：1分，26%～：2分，51%～：3分，≥76%：4分；將上述兩項分值的乘積作為最終結果，0分：陰性(-)，1～4分：弱陽性(+)，5～8分，陽性()，9～12分：強陽性()。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0進行分析，應用秩和檢驗比較CA組織和正常包皮組織中Bad、PCNA蛋白表達的差異，應用列聯系數分析CA組織中Bad和PCNA蛋白表達的關聯性，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1CA組織和正常包皮組織中Bad蛋白的表達

見圖1、表1。Bad陽性表達主要處于細胞膜和細胞質，陽性為棕黃色至棕褐色，大多數呈灶狀或者片狀并分布于棘細胞層中下部。53例CA組織中Bad蛋白陽性表達37例，其陽性表達率為69.8%，陽性表達強度多為～；28例對照組中Bad出現陽性表達有8例，其陽性表達率28.6%(8/28)，陽性表達強度多呈-～+。PCNA蛋白陽性表達主要位于細胞核，陽性顯色呈棕黃色或棕褐色，位于表皮的基底細胞層、棘細胞層、甚至顆粒層，為散在性或者彌漫性分布。53例CA組織中PCNA蛋白的陽性表達46例，其陽性表達率為86.8%，陽性表達強度大多數呈～；28例對照組中PCNA蛋白的陽性表達11例，其陽性表達率39.3%(11/28)，陽性表達強度多為+～。

A：Bad蛋白；B：PCNA蛋白；1：CA組織；2：正常包皮組織圖1 CA組織和正常包皮組織中Bad、PCNA蛋白的表達(SP，×400)

例

2.2CA組織中Bad和PCNA蛋白表達的關聯性

見表2。列聯系數分析發(fā)現Bad與PCNA在CA組織中的表達不相關(rP=0.134,P=0.325)。

表2 CA組織中Bad和PCNA蛋白表達的關聯性分析 例

3 討論

Bad是Bcl-2家族中經典的促凋亡蛋白成員之一，具有BH3同源結構域和序列，在人類正常組織細胞中均有陽性表達，乳腺、結腸、脾內以及睪丸等中出現較高水平的穩(wěn)定表達[2]。生理狀態(tài)下，磷酸化的Bad與14-3-3蛋白相結合，當凋亡相關信號刺激后，可誘導Bad表達水平升高或去磷酸化增強，通過易位和一些細胞活動來促進細胞發(fā)生凋亡[3]。當多種激酶作用于Bad時，可使Bad多個絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化，在某些因素下磷酸化的Bad處于無活性狀態(tài)，從而使細胞減少或免于凋亡[4-5]。研究[6-7]表明，Bad在多種疾病中的陽性表達有著重要的意義。本實驗結果顯示，53例CA組織中有37例Bad陽性表達，而在28例正常包皮組織中只有8例Bad陽性表達，差異有統(tǒng)計學意義，表明CA組織中存在Bad的過表達，這種過表達提示Bad在一定程度上促進CA組織中角質形成細胞的凋亡，可能是HPV病毒感染后Bad在多種因素影響下，通過酪氨酸激酶途徑激活細胞凋亡，從而一定程度上抑制CA組織細胞的異常增殖。但機體受到相關刺激或者某些激素的影響后，Bad發(fā)生磷酸化[8-11]，磷酸化Bad失去活性或者與其他成員結合形成復合物，發(fā)揮細胞抗亡的作用，間接促進CA組織細胞的過度增生。促凋亡蛋白Bad在CA組織中出現高水平的陽性表達，也提示Bad的表達過程受到其他相關因子或者激素的調控，但其具體機制不清楚，有待于進一步的研究。

PCNA為DNA聚合酶的一種輔酶，參與細胞異常增殖過程中DNA復制和細胞周期調控[12]，其表達程度和含量能夠準確地反映細胞的增殖狀態(tài)和生長速度情況，是細胞增殖狀態(tài)的理想標記物。因此，PCNA是目前普遍公認的腫瘤細胞S期的一種標志物，已被廣泛應用于細胞異常增生的實驗研究。本研究結果顯示，在正常上皮組織中，PCNA陽性表達率為39.3%，其陽性表達大部分在具有增殖、分化能力的基底細胞層及其附近細胞；而在CA患者組織中，PCNA陽性表達率高達86.8%，其陽性表達除在具有分化能力的基底細胞層外，分化相對良好的棘細胞層、甚至顆粒層中也出現PCNA的陽性表達，并且PCNA在CA組織中的陽性表達率和陽性表達強度均高于正常對照組，這與國內的一些研究[13]結果一致，其原因可能是HPV可以活化PCNA基因，HPV-DNA和HPV某些基因產物刺激PCNA在宿主細胞中出現過度表達，促進CA組織中表皮上層的細胞也增殖活躍，同時高表達的PCNA可以為受病毒感染的細胞復制提供所需要的大量元件，調節(jié)細胞由靜止期轉化為增殖期，導致HPV在棘層的上部細胞內順利地進行DNA復制，促使細胞中染色體也進行了大量的復制，從而導致棘細胞層甚至顆粒層細胞過度的異常增殖。

本實驗結果顯示，在CA組織中Bad和PCNA的陽性表達無明顯相關性，提示CA疾病的形成受到多種基因的調控，促凋亡蛋白Bad、PCNA及某些相關基因共同參CA的發(fā)生、發(fā)展，但其確切機制仍需進一步研究。

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