水通道蛋白1，3在變應性鼻炎大鼠鼻黏膜的表達及促鼻內(nèi)腺體分泌的研究

許敏達

變應性鼻炎是一種常見的耳鼻喉科疾病，其發(fā)病率高達30%[1-2],臨床表現(xiàn)為噴嚏、鼻溢、鼻癢等癥狀。目前臨床藥物治療效果欠佳，考慮可能與變應性鼻炎發(fā)生機制尚未闡明有關[3]。有研究表明，水通道蛋白(AQP)在維持機體液體轉運平衡中起著極其重要的作用，而變應性鼻炎的高分泌性可能與AQP的表達異常有關[4-5]。本研究探討AQP與變應性鼻炎的關系，并分析其在變應性鼻炎大鼠鼻黏膜的表達情況及對腺體分泌的影響，旨在為變應性鼻炎的治療提供實驗依據(jù)。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 健康清潔級健康大鼠40只購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心，雌雄不拘，體重為200～300 g，將大鼠隨機分為實驗組和對照組，每組20只，動物的飼養(yǎng)過程均符合西安市實驗動物管理規(guī)定。

1.2實驗試劑及儀器 卵白蛋白(OVA)購自美國Sigma公司；AQP1,3抗體購自美國PE公司；SP免疫組化試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；RM2145型切片機購自德國LEICA公司，奧林巴斯生物顯微鏡購自上海光學儀器五廠；電熱恒溫鼓風干燥箱購自上海姚氏儀器設備廠；HH-600-數(shù)顯三用恒溫水箱購自江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所。

1.3實驗方法

1.3.1模型制備:根據(jù)許海波[6]和李欽等[7]的方法進行造模。實驗組以OVA經(jīng)全身致敏并進行強化致敏，每天以1 mg/ml OVA滴鼻，對其進行激發(fā)，直至建立大鼠變應性鼻炎動物模型。具體操作步驟：將大鼠分組后，先適應性喂養(yǎng)1周。首先全身致敏：采用10%水合氯醛3 ml/kg對大鼠進行麻醉，并于大鼠左右前肢和后肢跖部皮下各一點注射0.2 ml和0.3 ml的抗原佐劑混懸液[每毫升含1 mg OVA，2 mg Al(OH)3]進行致敏。初次致敏5 d后開始強化致敏，在大鼠背部皮下10處注射0.5 mg OVA(溶于1 ml生理鹽水)；自初次致敏后第7天起每天用1 mg/ml OVA滴鼻1次(含有OVA溶液均以生理鹽水配制)，每次20 μl，并觀察滴鼻后大鼠打噴嚏、搔鼻的次數(shù)及鼻塞情況，每次觀察30 min，并記錄。模型建立后沿中線打開鼻腔后，以小棉棒輕輕擦取鼻腔黏膜表面的黏液，做涂片后行免疫組化染色。

1.3.2模型制備成功標準:連續(xù)觀察3～4周，并進行疊加積分評價動物模型，當積分>5分時表示成功造模[6]。對搔鼻和噴嚏次數(shù)分別進行統(tǒng)計并計分。0分:鼻塞正常,吸氣明顯，鼻翼扇動；1分:鼻塞,濕啰音可聽到，且吸氣明顯，鼻翼扇動；2分:鼻塞，濕啰音明顯，吸氣明顯，鼻翼扇動；3分：鼻塞，濕啰音明顯，且出現(xiàn)次數(shù)較多≥2次。

1.4觀察指標

1.4.1血清學檢測：血清中Ca2+、K+、Na+和Cl-濃度應用間接電極的方法進行檢測。

1.4.2免疫組化染色：AQP1,3的檢測應嚴格按試劑盒說明操作(兔抗大鼠多克隆抗體)，實驗中AQP的陽性對照用豚鼠腎臟做對比，陽性是腎小管上皮細胞胞漿中染色為褐色。本實驗利用PBS來代替一抗作為陰性對照，采用Image-Pro Plus 6軟件計算平均光密度值，計算表達面積的比值。

1.4.3鼻內(nèi)腺體分泌率檢測：大鼠麻醉后，在20℃下，用棉線著染段置于一側鼻中段前下方黏膜處，靜止不動，5 min后取下棉線，立即測量棉線熒光素染色長度，棉線吸收率為0.054 μl/min，測得熒光棉線染色長度(mm)乘以吸收率為鼻內(nèi)腺體分泌量。

2 結果

2.1血清離子濃度 實驗組血清Ca2+和K+濃度較對照組降低，Na+濃度較對照組升高(P<0.01)；兩組血清Cl-濃度比較差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2AQP1，3表達情況 兩組大鼠AQP1，3在鼻黏膜中表達不等，見圖1。對照組AQP1.3表達面積為(14.84±1.56)%，實驗組為(21.32±2.43)%。實驗組AQP1,3表達面積較對照組增加(P<0.05)。

表1 兩組大鼠血清離子濃度比較

注：對照組為正常大鼠，實驗組為變應性鼻炎模型；與對照組比較，bP<0.01

圖1兩組大鼠鼻黏膜水通道蛋白1,3表達情況(SP×200)

A.對照組；B.實驗組

2.3鼻內(nèi)腺體分泌情況 對照組鼻內(nèi)腺體分泌量為(0.58±0.07)μl/min，實驗組為(2.07±0.36)μl/min。實驗組鼻內(nèi)腺體分泌量高于對照組(P<0.05)。

3 討論

變應性鼻炎模型的建立基本上都分為致敏階段和激發(fā)階段，但是對于模型建立過程中的細節(jié)，不同的研究單位和實驗室有著不同的建模方案，本實驗以OVA經(jīng)全身致敏，強化致敏后，以1 mg/ml OVA每天滴鼻，進行激發(fā)，直至建立大鼠變應性鼻炎動物模型。

鼻黏膜受體可以與醛固酮發(fā)生結合作用，這種結合作用有效地降低內(nèi)淋巴液中K+濃度,增加Na+濃度，以及由此通過K+濃度改變內(nèi)、外淋巴液滲透壓[7]。因此醛固酮的增加可上調(diào)大鼠鼻黏膜AQP1,3的表達水平，并與其結合，AQP1,3表達的增加可能會直接改變水在鼻內(nèi)的分布狀態(tài)，誘導水代謝失調(diào)，進而發(fā)生變應性鼻炎。本研究結果顯示，實驗組血清Ca2+和K+濃度低于對照組，Na+濃度高于對照組，提示變應性鼻炎的發(fā)生和AQP1,3的表達增加可能與機體醛固酮水平改變有關。

AQP1,3在不同組織表達部位的水平不同。有研究報道，AQP1,3在眼部的表達豐富：睫狀體非色素上皮、小梁網(wǎng)內(nèi)皮細胞、角膜內(nèi)皮細胞、晶狀體均有表達[8]。Stamer等[9]研究顯示，AQP1,3可能參與眼房水形成，青光眼的發(fā)病可能與其表達失衡有關。AQP1,3也表達于腦脈絡膜上皮微絨毛細胞頂質膜，參與了水液由血液進入腦脊液的主動轉運過程，而且對大腦急性損傷時導致腦水腫的形成有重要作用[10]。AQP1,3在大鼠和人近端小管和髓袢降支上皮細胞的頂端和基底外側膜均有表達[11-12]，并參與腎臟水液的重吸收，以及對滲透梯度的形成有重要作用。然而，AQP1,3并未在大鼠鼻咽或鼻甲表層上皮檢測到，但在鼻咽上皮下毛細血管和小靜脈及鼻甲中毛細血管和靜脈竇表達水平較高[13]。AQP1,3在肝膽管內(nèi)皮細胞基底外側膜上及尿路上皮、鼻息肉中也有表達。本研究發(fā)現(xiàn)，AQP1,3在鼻黏膜上皮下成纖維細胞、毛細血管內(nèi)皮細胞及血竇內(nèi)皮細胞表達豐富；而在上皮細胞層、黏膜內(nèi)腺體及導管均未見AQP1,3抗體標記，且實驗組AQP1,3表達水平高于對照組。提示AQP1,3的增加可能會誘導了內(nèi)淋巴的生成增多，導致變應性鼻炎的發(fā)生。 與江一鳴等[13]研究結果一致。

變應性鼻炎時，經(jīng)變應原激發(fā)毛細血管通透性增加，腺體分泌增強是大量鼻涕產(chǎn)生的主要液體來源。本研究結果顯示，實驗組鼻內(nèi)腺體分泌量高于對照組。提示AQP1,3的增加可能會誘導鼻內(nèi)腺體活性增強，使其腺體分泌增加。 依據(jù)AQPs分布部位，AQP1,3表達增強，有利于上皮下組織液通過上皮層細胞，以及利于液體經(jīng)腺細胞轉運至腺管，促進大量鼻涕的產(chǎn)生，提示膜迷路積水的發(fā)生可能是由于AQP1,3表達增加誘導了內(nèi)淋巴產(chǎn)生增多導致的，但其發(fā)病機制仍需要進一步探明。

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