香菊片對變應性鼻炎大鼠血清相關細胞因子及維持纖毛系統正常功能的研究

李 斐

變應性鼻炎是機體接觸過敏原后所發生的由特異性抗體lgE介導，發生在鼻腔或鼻黏膜的，致肥大細胞致敏性增加的慢性變態反應性疾病[1],與哮喘有關[2]。鼻腔黏膜腺體中分泌物和大分子氣體對氣道內表面液體平衡保持和細菌入侵抵御有重要作用[3-4]。有研究發現，香菊片治療慢性鼻炎、鼻竇炎等效果較好[5]，但對于其調節變應性鼻炎血清細胞因子和維持纖毛系統正常功能的研究較少。本研究探討香菊片對變應性鼻炎大鼠鼻黏膜及鼻纖毛變化的影響，觀察IgE、白介素-4(IL-4)、IL-8水平。

1 材料與方法

1.1實驗材料 香菊片購于陜西香菊制藥有限公司，卵清蛋白(OVA)購于美國Sigma公司，其他試劑購于國藥集團化學試劑有限公司。挑選健康清潔級健康Wistar大鼠30只，雌雄不限，體重200～250 g。

1.2變應性鼻炎模型制備及分組 選取6只大鼠作為空白對照組(未添加任何處理)，其余24只大鼠均給予OVA經全身致敏，空白組每日腹腔注射等量生理鹽水，模型組以0.5 mg OVA溶于 1 ml 生理鹽水中，并于大鼠背部皮下10處注射，OVA經全身強化致敏后第 7 天起每天一次用 1 mg/ml OVA 滴鼻(含有 OVA 溶液均以生理鹽水配制)，每次 20 μl，每日1次，共10次[6]。模型建立成功標準：根據鼻癢程度評定：輕擦鼻多次為1分；頻繁重度的抓搔面、鼻為2分。根據清涕流至位置評定：流至前鼻孔處為1分，流至超過前鼻孔處為2分，流至滿面時為3分。根據噴嚏的個數評定：10 min內1～3個為1分，4～10個為2分，>11個為3分。以上3種評定方式疊加量化評分>5分即為造模成功。模型制備成功大鼠隨機分為模型組、陽性對照組、香菊片低劑量組(鼻飼香菊片50 mg/kg)和香菊片高劑量組(鼻飼香菊片200 mg/kg)，每組6只。

1.3干預方法 空白對照組和模型組均以等體積的蒸餾水代替藥物；陽性對照組采用氯雷他定(西安楊森制藥有限公司，國藥準字H20070030) 85 mg/kg灌胃給藥；香菊片低劑量組給予鼻飼香菊片50 mg/kg；香菊片高劑量組給予鼻飼香菊片200 mg/kg。5組均在10% OVA生理鹽水滴鼻之前30 min給藥，每天1次，共10次。

1.4HE染色觀察鼻黏膜病理形態 4周后，用水合氯醛麻醉小鼠，打開鼻腔輕取鼻腔黏膜，去除周圍結締組織和血管分支，用肝素抗凝生理鹽水沖洗殘留血液，固定于 4%多聚甲醛溶液中24 h，將組織脫水浸蠟，包埋，切片，厚度4～5 μm，42℃純水中展片，粘附載玻片撈片，烤片機62℃烘片1 h，72℃烤箱烤片2 h后，行HE染色，染色后，乙醇脫水，二甲苯透明處理，切片滴上樹膠，蓋玻片封固。待樹膠干后，在光學電子顯微鏡下觀察大鼠鼻腔鼻黏膜病理形態的改變及嗜酸性粒細胞的浸潤情況。

1.5細胞因子水平檢測 取5組大鼠血清用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清IgE、IL-4、IL-8水平。

1.6掃描電鏡觀察鼻黏膜形態 4周后，用水合氯醛麻醉小鼠，打開鼻腔后，輕取鼻腔黏膜，去除周圍的結締組織和血管分支，用肝素抗凝的生理鹽水沖洗去殘留血液，固定于4%多聚甲醛溶液中24 h，觀察鼻黏膜形態，用PBS緩沖液反復沖洗雙側鼻腔黏膜后，固定于2.5%戊二醛溶液中，封口避光保存，固定24 h后，用掃描電鏡觀察。

2 結果

2.1鼻黏膜病理形態和嗜酸性粒細胞的浸潤情況 正常組鼻黏膜血管數量少，黏膜下致密纖維結締組織較薄，無血管改變和炎性細胞浸潤；模型組鼻黏膜小血管明顯增生擴張，且鼻黏膜增厚，上皮下大量炎性細胞浸潤，腺體擴張，上皮分泌細胞增多，黏膜下腺體數量明顯增加，小血管無明顯擴張；香菊片低劑量組與陽性對照組比較炎性細胞浸潤程度明顯降低；香菊片高劑量組鼻黏膜厚度與陽性對照組比較無明顯降低，而炎性細胞浸潤程度明顯減輕，小血管、腺體數量也減少。見圖1。

圖1 5大鼠鼻黏膜組織病理形態(HE×100) A.空白對照組；B.模型組；C.香菊片低劑量組；D.香菊片高劑量組；E.陽性對照組

2.2血清IgE、IL-4、IL-8水平 模型組血清IgE、IL-4、IL-8水平明顯高于空白對照組(P<0.01)；陽性對照組、香菊片低和高劑量組血清IgE、IL-4、IL-8水平均較模型組降低，且陽性對照組低于香菊片低和高劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 5組治療前后血清免疫球蛋白E、白介素-4、白介素-8水平比較

注：空白對照組為正常大鼠，模型組、陽性對照組、香菊片低、高劑量組均為變應性鼻炎動物模型，陽性對照組給予氯雷他定鼻飼，香菊片低、高劑量組鼻飼劑量分別為50、200 mg/kg；與空白對照組比較，bP<0.01；與模型組比較，aP<0.05，dP<0.01;與香菊片低劑量組比較，cP<0.05；與香菊片高劑量組比較，eP<0.05

2.3鼻腔纖毛變化 空白對照組鼻黏膜纖毛長度及直徑一致，纖毛整齊，密集，擺動規律，微管結構規則；模型組鼻黏膜呈大片狀，大量黏附于纖毛頂端，且密度較大，陽性對照組纖毛密集，局部略雜亂，微管結構清晰；香菊片低劑量組纖毛密集，較整齊，偶見局部少量纖毛略雜亂；香菊片高劑量組纖毛之間無粘連，微管結構清晰。見圖2。

圖2 5組大鼠鼻腔纖毛超微結構電鏡觀察(×100) A.空白對照組；B.模型組；C.香菊片低劑量組；D.香菊片高劑量組；E.陽性對照組

3 討論

香菊片由化香樹果序、防風、夏枯草、野菊花、辛夷、白芷、黃芪、甘草等中藥組成[7-8]，其中香樹果序具有宣通鼻竅，疏風散邪的功效；防風、夏枯草、野菊花具有清熱解毒，祛風消腫功效；黃芪補脾益腎、祛風解表，增強免疫力；辛夷具有抗組胺及收縮鼻黏膜血管的作用，能有效緩解變應性鼻炎鼻癢、噴嚏、流涕癥狀；甘草調和諸藥，且現代藥理學研究發現，上述中藥配方中，含有大量黃酮及其他活性物質，具有調節免疫、增強機體免疫力的功效[9-14]。

變應性鼻炎是由IgE所介導的過敏性疾病[15]。在變應性鼻炎的發病過程中，會有嗜酸性粒細胞浸潤、T細胞的活化和肥大細胞的聚集等作用的發生[16]。有研究發現，肥大細胞在過敏反應的早期階段發揮著非常重要的作用[17]。當特異性個體與過敏原接觸后，肥大細胞表面相關的受體FcεRI將會與IgE介導的過敏原結合，誘導肥大細胞釋放組胺、炎性細胞因子、白三烯等，這些炎性介質誘導鼻黏膜病理形態的改變，進而出現鼻癢、流鼻涕、打噴嚏等癥狀[18-21]。研究發現，IL-8在IgE的生成過程中有著重要的促進作用[22]。本研究結果顯示，香菊片低和高劑量組血清IgE、IL-4、IL-8水平均較模型組降低，提示香菊片能夠通過調節相關細胞因子的水平來改善變應性鼻炎的癥狀。

在鼻腔中，鼻黏膜纖毛是其非特異性免疫保護的重要結構，纖毛微管蛋白臂滑動有助于黏膜表面黏液的清除。纖毛受損會嚴重影響纖毛清除功能[23]。本研究結果顯示，香菊片可使纖毛密集整齊，纖毛之間無粘連，微管結構清晰，提示香菊片能有效促進纖毛增生，修復損傷的鼻黏膜，緩解鼻黏膜病理學改變，從而減輕變應性鼻炎流涕及噴嚏等癥狀。

綜上所述，香菊片對變應性鼻炎大鼠鼻黏膜形態及功能的具體作用機制可能是通過調節相關細胞因子的水平、降低特異性IgE水平，從而改善變應性鼻炎的癥狀。香菊片相關的調控信號途徑等仍需進一步研究，以期發揮祖國傳統醫藥之優勢，挖掘出不良反應小、效果佳的治療變應性鼻炎中藥制劑。

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