組織工程脂肪微環境中影響血管化的因素

劉曉慧　劉毅

[摘要]脂肪組織工程中構建的組織塊體積較小，主要與所構建的脂肪組織中新生血管生成不充分有關。脂肪組織是人體組織中血管分布最豐富的組織，每一個脂肪細胞都被豐富的毛細血管網所圍繞，因此如何有效構建血管化組織工程脂肪成為再生醫學的熱點問題。脂肪組織工程三要素：種子細胞；與種子細胞具有良好生物相容性的三維支架和調控脂肪組織生長的微環境。本文擬就調控脂肪組織生長的微環境來分析影響構建血管化組織工程脂肪的因素。

[關鍵詞]脂肪組織工程；脂肪組織；組織工程微環境；血管化；細胞因子

[中圖分類號]R622 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2017）06-0129-04

脂肪組織工程中修復軟組織缺損時，構建出的脂肪組織體積往往較小，主要與所構建的脂肪組織中新生血管生成不充分有關。而脂肪組織中每一個脂肪細胞都被豐富的毛細血管網所圍繞，是人體中血管分布最豐富的組織，在再生醫學領域，如何構建血管化組織工程脂肪成為一大難題。脂肪組織工程具有三要素：種子細胞；與種子細胞具有良好生物相容性的三維支架和調控脂肪組織生長的微環境；每一個要素都直接影響血管化組織工程脂肪的形成。本文擬就調控脂肪組織生長的微環境來分析影響構建血管化組織工程脂肪的因素。

1組織工程脂肪的血管生成

脂肪組織工程中脂肪組織血管的生成主要表現為內皮細胞的增殖及遷移，通過細胞間連接進而形成管腔，在血管周圍支持細胞協同下，與現有的血管吻合，從而形成循環。脂肪組織中脂肪干細胞、前脂肪細胞、脂肪細胞以及炎性細胞可通過旁分泌作用，分泌各種細胞因子促進血管的形成。白色和棕色脂肪組織均可產生多種促血管生成生長因子，包括血管內皮生長因子A（VEGF-A），肝細胞生長因子（HGF），酸性和堿性成纖維細胞生長因子（aFGF/bFGF），瘦素等以及抗血管生成因子，包括血小板反應蛋白-1（TSP-1）或其他血管生成調節劑如纖溶酶原激活物抑制劑或脂聯素，這些因子共同決定脂肪組織中生成的血管表型。巨噬細胞、其他炎性細胞和基質細胞同樣參與血管生成的調節。

2促進血管生成的因素

2.1血管內皮生長因子（Vascular endothel ial growthfactor，VEGF）：VEGF家族在脂肪組織工程微環境中與血管生成的關系最為密切，活性最強，是1989年Ferrara和Henze從牛垂體濾泡細胞體外培養液中首次分離純化出來的，主要由血管基質成分及成熟的脂肪細胞表達。在所有的脂肪組織中，大網膜表達最高水平的VEGF。VEGF家族包括A、B、C、D、E、F以及胎盤生長因子（Placental growthfactor，PIGF），以不同的方式與三種酪氨酸激酶受體結合，即VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3。VEGF家族成員中主要發揮作用的是VEGF-A，許多研究表明，VEGF-A在生理性和病理性血管形成中至關重要。VEGF-A主要結合VEGFR1和VEGFR2，VEGFR1表達于血管內皮細胞、周皮細胞、單核細胞、巨噬細胞、胎盤滋養細胞和造血干細胞，誘導單核細胞、巨噬細胞增殖及血管的發生及生成。而VEGFR2主要表達于血管內皮細胞，誘導血管的形成。VEGF-C和VEGF-D主要作用于VEGFR3，VEGFR3在發育期間存在于所有內皮細胞，但在成體中局限于淋巴管及部分網狀血管內皮表面，因此VEGF-CS和VEGF-D主要參與淋巴管的形成及細胞外基質（EcM）的降解。胎盤生長因子（PIGF）僅在病理條件下作用于VEGFR1促進血管的生成。亢婷等將攜帶VEGF165基因的慢病毒轉染脂肪間充質干細胞，VEGF呈持續表達，在Wistar大鼠體內成功構建出組織工程脂肪；Zhang Q等將含有VEGF的PLGA/PEG微球包裹于接種脂肪干細胞的膠原殼聚糖支架中，并種植于裸鼠的體外組織工程室模型中，8周后相比較對照組，實驗組新生血管以及脂肪組織明顯增加。

2.2肝細胞生長因子（HGF）：HGF由間充質產生，并且通過激活c-Met受體的酪氨酸磷酸化，刺激各器官中的上皮細胞進行有絲分裂，進而增殖、運動，導致人體形態的發生和血管生成。HGF/c-Met信號通路同時可協同VEGF/VEGFR信號通路參與血管生成的調節。研究表明與VEGF和bFGF不同的是，HGF在誘導成熟的血管形成的過程中，不激活NK-KB途徑，而NK-KB途徑激活引起炎癥，可導致血管通透性的升高，因此，HGF僅僅促進血管的生成，而不誘導炎癥的發生及血管通透性的增加。

2.3堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）：bFGF是由Gospodarowiz等于1974年在牛腦垂體中分離純化，bFGF可通過激活Akt/MMP-2信號通路等多種機制顯著誘導血管生成，Monti等發現激活PKCε可顯著促進內皮細胞分泌bFGF，而bFGF可上調VEGF受體的表達，進而促進血管新生。研究表明，在含有脂肪間充質干細胞的移植物中加入bFGF，相對于對照組，實驗組中VEGF呈現高表達，而血小板源性生長因子BB（platelet derived

growthfactor-BB，PDGF BB）以及基質金屬蛋白酶-2（matrixmetalloproteinase-2，MMP-2）的表達無明顯變化，說明bFGF是通過依賴VEGF途徑來誘導血管的生成，二者協同作用從而誘導血管的生成。

2.4胰島素樣生長因子（IGF）：IGF是一種天然生長激素，IGF家族由IGF-1和IGF-2兩種組成，二者特異性結合細胞表面受體，并激活各種細胞內信號傳導，從而調節細胞功能。對IGF的細胞應答主要由IGF-1受體介導，IGF-1受體屬于酪氨酸激酶生長因子受體。s.galajfi等最近研究通過建立小鼠體內及體外傷口模型，證實了IGF-1可促進傷口愈合，促使血管生成，但IGF-1不會導致VEGF的上調，其誘導血管生成并不依賴于VEGF途徑。目前IGF-1促進血管生成的具體機制尚未清楚，需進一步研究證實。endprint

2.5瘦素（Leptin）：瘦素是由脂肪細胞合成分泌的內分泌激素，在中樞和外周組織中的能量穩態平衡中起關鍵作用，參與生殖、免疫、骨增殖和血管生成的調節，并通過作用于弓狀核來調節脂肪儲存。多項研究表明瘦素可以是有效的血管生成因子或血管生成誘導劑，在角膜囊及雞絨毛尿囊膜（CAM）兩種體內血管生成測定模型中發現瘦素可直接作用于血管內皮細胞和平滑肌細胞的瘦素受體，誘導血管的生成，同時也可通過調節VEgF，TSP-1和Ang-2，作為間接血管生成因子起作用。瘦素通過Jak/stat3信號通路調節VEGF的表達，并通過JAtC2和MAPK依賴性通路來上調血管平滑肌細胞中的TSP-1表達，在血管生成的穩定性中發揮作用。

2.6神經肽Y（NPY）：NPY是另一種內分泌和旁分泌因子，是具有多效作用的交感神經遞質，神經肽Y和NPY受體在哺乳動物中樞神經系統中廣泛表達。主要在中樞和外周組織起作用，影響脂肪組織的形成。在脂肪組織生成過程中，NPY通過激活血管內皮細胞中的Y2受體，從而在體外和體內刺激血管生成，并且實驗表明小鼠體內Y2受體的缺失會導致傷口愈合延遲。進一步證實了NPY在組織缺損修復中具有促進血管生成的作用。

2.7低氧誘導因子1-α（HIF-1α）：HIF-1α是缺氧信號的主要介質，是生理或病理狀況下血管生成的主要觸發因素。實驗表明，在低氧環境中，VEGF和b-FGF的mRNA和蛋白質含量明顯上升，明顯促進血管內皮細胞的生長，減少內皮細胞凋亡。以低氧環境處理ADSCs，以延長其生存能力和激發干細胞特性，促使血管生成可能是今后研究的方向之一。同時，ADSCs在缺氧的環境中可以釋放氧化物質、自由基及分子伴侶、熱休克蛋白等，清除受損局部區域的細胞毒性物質，促進存活細胞的生物學活性。

3參與調節血管生成的因素

3.1血管生成素（Ang）：kng是VEGF的重要的配體。該系統包括血管生成素-1和-2（Ange-1和Ang-2），并且結合與Ig和表皮生長因子具有同源結構域的酪氨酸激酶（Tie：Tiel和Tie2）受體。Tiel受體對于血管發生無明顯活性，Ang-1和Ang-2通過活化Tie2受體促進血管的發生：Ange-1主要參與血管壁重塑，成熟和穩定，介導內皮細胞的遷移，粘附和存活；Ang-2則破壞內皮和血管周圍細胞之間的連接并促進細胞死亡和血管退化。但Ang-2聯合VEGF又能促進新血管形成。

3.2轉化生長因子B（TGF-β）：TGF-β家族包括TGF-β₁，TGF-β₂和TGF-β₃，主要作用于細胞的增殖、分化及遷移，參與炎癥，也參與血管生成。許多小鼠和人類的遺傳研究發現了在血管生成過程中轉化生長因子-β信號轉導的關鍵作用。TGF-β主要通過兩種相對的Ⅰ型受體/Smad通路活化內皮細胞，即ALK1和ALK5，直接作用于內皮細胞的生長和遷移，并間接參與調節血管生成。TGF-β在脂肪細胞和基質細胞中表達，可以根據內皮細胞中的濃度和受體類型正向和負向調節血管生成。TGF-β在體內誘導血管生成的機制尚不清楚。

3.3血小板反應蛋白（TSP）：TSP是由血小板分泌的糖蛋白，TSP-1和TSP-2是血管發生的有效內源性抑制劑。它們直接作用于內皮細胞，并通過拮抗VEGF的活性來抑制血管生成。TSP-1作用于血管內皮細胞上的CD36和CD47受體，調節內皮細胞的遷移、增殖及凋亡，從而抑制新血管的生長，并可活化處于休眠期的TGF-β，而TSP-2可競爭性抑制TSP-1介導的TGF-B活化，共同參與脂肪組織中血管形成的調節。

3.4脂聯素（adiponectin）：脂聯素是由脂肪細胞分泌的脂肪因子，脂聯素在循環中主要有三個亞型：低分子量的三聚體，中等分子量的六聚體和高分子量的多聚體。高分子量多聚體是主要的活性蛋白。在內皮細胞上主要有兩種脂聯素受體，即R1和R2受體。脂聯素的主要作用靶點在內皮細胞，激活半胱氨酸蛋白酶，誘發內皮細胞凋亡，抑制單核細胞黏附到內皮細胞，最終抑制內皮細胞及血管平滑肌細胞的增殖、遷移和存活。脂聯素同時具有胰島素增敏、抗動脈粥樣和抗炎特性。

3.5炎性細胞：脂肪組織中炎性浸潤細胞和脂肪細胞可產生高水平的促血管生成因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α），白細胞介素（IL）-1β，IL-6和IL-8。其中，TNF-α在炎癥反應中作用顯著，TNF-α在體外可促進內皮細胞形成并抑制內皮細胞增殖。除了其直接的血管生成活性，TNF-α是一種有效的炎性細胞因子，將炎癥、血管生成和脂肪的形成聯系起來。TNF-α還可以抑制脂肪細胞中脂聯素的mRNA表達。此外，IL-6可促進脂肪組織產生VEgF，從而促進血管的形成。

3.6基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）：許多證據表明了基質金屬蛋白酶（MMP）系統在脂肪組織血管生成的潛在作用，其位于細胞外基質（ECM），包括切割所有ECM和非ECM組分的蛋白酶以及MMP的組織抑制劑（TIMP）。組織蛋白酶屬于半胱氨酸蛋白酶家族，對ECM中的彈性蛋白和膠原蛋白具有水解作用，在人類病原生物學中發揮重要作用，其中，組織蛋白酶B由脂肪組織分泌，可以同時調節促血管生成因子和抗血管生成因子。另外，ADAM（去整合素和金屬蛋白酶）和ADAMTS（具有TSP基序的ADAM）蛋白也具有調節血管生成和脂肪生成的功能。

4展望

脂肪組織微環境中存在各種細胞因子，它們分別發揮著不同的效應，共同調節血管的形成、生長及維持血管的穩定性。在構建組織工程脂肪過程中，脂肪干細胞分化成脂肪細胞、內皮細胞，脂肪細胞再與內皮細胞相互作用，共同調節脂肪組織的生長。微環境中的各種細胞因子是必不可少的，要實現組織工程脂肪的血管化，需要了解微環境中各種影響脂肪組織血管生成的因素，從而建立一個良好的微環境。因此進一步完善各種影響因子的調控機制及相互作用，研究如何使組織工程微環境中各種促進血管生成因子在血管形成及生長過程中維持適當的濃度，對構建血管化組織工程脂肪具有重要的意義。

[收稿日期]2017-01-18

[修回日期]2017-05-21

編輯/張惠娟endprint