HIF—1α與TLR4在鼻息肉組織中的表達及相互關(guān)系

崔粲+任金龍+王銀霞

【摘要】 目的：檢測HIF-1α、TLR4在鼻息肉組織中的表達及相關(guān)性，探討其在鼻息肉發(fā)病機制中可能的作用。方法：選取30例經(jīng)鼻內(nèi)鏡手術(shù)治療的鼻息肉患者的鼻息肉組織為試驗組，及同期30例經(jīng)鼻中隔偏曲矯正術(shù)治療的患者的下鼻甲黏膜為對照組。采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測兩組標本中HIF-1α、TLR4的表達情況。結(jié)果：試驗組HIF-1α、TLR4表達水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；經(jīng)Pearson相關(guān)性分析得出，試驗組中HIF-1α、TLR4表達呈顯著正相關(guān)性（r=0.907，P<0.01）。結(jié)論：HIF-1α、TLR4在鼻息肉組織中表達水平上調(diào)并且呈顯著正相關(guān)性，提示鼻息肉發(fā)生過程中組織缺氧、感染存在，HIF-1α、TLR4可能通過某種機制相互促進，共同導(dǎo)致鼻息肉的發(fā)生。

【關(guān)鍵詞】 鼻息肉； HIF-1α； TLR4

【Abstract】 Objective：To investigate the expression and correlation of HIF-1α and TLR4 in nasal polyps，and to discuss the possible role of them in the pathogenesis of nasal polyps. Method：The nasal polyps of 30 patients with nasal polyps treated by nasal endoscopic surgery were selected as the experimental group，the same period，the inferior turbinate mucosa of 30 patients with nasal septum surgery were selected as the control group.Immunohistochemical staining technique was used to detect the expression of HIF-1α and TLR4 in two groups of specimens.Result：The expression levels of HIF-1αand TLR4 in the experimental group were significantly higher than those in the control group，and the differences were statistically significant（P<0.01）.Pearson correlation analysis showed that there was a significant positive correlation between the expression of HIF-1αand TLR4 in the experimental group（r=0.907，P<0.01）.Conclusion：The levels of HIF-1α and TLR4 in nasal polyps are up-regulated and positively correlated，it suggests that tissue hypoxia and infection exist during nasal polyps，HIF-1αand TLR4 may promote each other through some mechanism，which can lead to nasal polyps.

【Key words】 Nasal polyp； HIF-1α； TLR4

First-authors address：Graduate School of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.02.001

鼻息肉是鼻腔及鼻竇黏膜的慢性炎癥性疾病，致病因素目前不清楚，考慮是許多誘因綜合作用的結(jié)果，其組織學(xué)特征為組織間隙水腫，嗜酸性粒細胞為主的炎性細胞浸潤，基質(zhì)中有散在、不成熟的血管交錯，缺乏正常神經(jīng)支配及細胞連接[1]。近年來研究表明鼻腔、鼻竇黏膜組織的缺氧及感染可能促進了鼻息肉的形成及發(fā)展，而HIF-1α、TLR4在組織中異常表達或許起主導(dǎo)作用[2-4]。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β兩亞基聚合而成，負責調(diào)控低氧環(huán)境中組織細胞增殖、代謝及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，而HIF-1α為HIF-1表達水平、活性及穩(wěn)定性調(diào)控亞基[5]。TLR4受體為天然免疫模式識別受體，是Toll樣受體的主要組成部分，主要通過識別病原微生物的細胞壁成分激活機體免疫系統(tǒng)，發(fā)揮免疫防御及免疫調(diào)節(jié)等作用[6]。本試驗旨在運用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測上述兩因子在鼻息肉中的表達情況，進一步明確HIF-1α、TLR4在鼻息肉發(fā)生中的作用及可能的內(nèi)在關(guān)系。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 鼻息肉組織來源于2016年

3月-2017年3月在山西醫(yī)科大學(xué)附屬汾陽醫(yī)院耳鼻咽喉科行鼻內(nèi)鏡手術(shù)治療的30例鼻息肉住院患者列為試驗組，選取同期30例行鼻中隔偏曲矯正下鼻甲部分切除術(shù)治療的鼻中隔偏曲住院患者的下鼻甲黏膜組織為對照組。試驗組納入標準：根據(jù)患者癥狀、體征及輔助檢查診斷為鼻息肉并且術(shù)后經(jīng)病理證實。對照組納入標準：根據(jù)患者癥狀、體征、輔助檢查診斷明確且需手術(shù)治療的患者。排除標準：所有患者均可排除變應(yīng)性鼻炎、支氣管哮喘、阿司匹林三聯(lián)征、囊性纖維化等疾病，并且術(shù)前2周內(nèi)均未使用過糖皮質(zhì)激素、抗組胺類藥物，未患過流行性感冒等病毒性疾病及上呼吸道感染。標本取材經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，并告知患者經(jīng)得患者同意且術(shù)前簽知情同意書。試驗標本均取材于術(shù)中，endprint

-78 ℃冰箱保存，10%中性福爾馬林溶液固定，然后進行石蠟包埋，制成石蠟塊儲存。

1.2 免疫組織化學(xué)染色檢測 采用免疫組織化學(xué)染色SABC法。石蠟塊經(jīng)切片機連續(xù)3 μm切片制成石蠟切片，經(jīng)烤片機60 ℃烘烤0.5 h使切片緊密黏附。切片脫蠟至水，抗原熱修復(fù)。加入5%BSA封閉液37 ℃孵育30 min甩干。分別滴加一抗小鼠抗人HIF-1α、TLR4單克隆抗體（sc-13515，sc-293072購于美國Santa Cruz公司），工作濃度為1∶50，4 ℃過夜。滴加二抗生物素標記山羊抗小鼠IgG（購于武漢博士德SA1021-小鼠IgG即用型免疫組化染色試劑盒），37 ℃孵育30 min。PBS沖洗5 min×3次。滴加SABC，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次。滴加DAB，鏡下控制反應(yīng)時間，然后自來水沖洗終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染2 min，放入鹽酸酒精分化液中分化數(shù)秒。脫水、透明、封片。PBS代替上述一抗做陰性對照。

1.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定 HIF-1α以細胞質(zhì)或細胞核出現(xiàn)棕黃染色為陽性細胞，TLR4以細胞膜或細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃染色為陽性細胞。使用美國aperio公司Scanscope數(shù)字病理掃描系統(tǒng)，每張組織切片于400倍鏡下隨機選取5個不重疊的陽性區(qū)域，統(tǒng)一測量窗下，讀取鎖定區(qū)域的灰度值，取均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗。應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析研究指標間的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基線資料比較 試驗組30例患者，其中男17例，女13例，年齡22～70歲，平均（43.3±5.2）歲；對照組30例患者，其中男19例，女11例，年齡27～68歲，平均（42.5±4.3）歲。兩組患者一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 免疫組織化學(xué)染色檢測結(jié)果 HIF-1α在鼻息肉組織主要表達于上皮細胞、腺體細胞、部分炎性細胞及血管內(nèi)皮細胞細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)，染色呈棕黃色；在下鼻甲黏膜組織僅表達于部分上皮細胞細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)，染色黃色至棕黃色不等。TLR4在鼻息肉組織主要表達于上皮細胞、腺體細胞、固有層炎性細胞細胞膜或細胞質(zhì)中，染色呈棕黃色；在下鼻甲黏膜組織表達于上皮細胞、腺體細胞及部分炎性細胞細胞膜或細胞質(zhì)中，染色黃色至棕黃色不等。見圖1～4。

2.3 兩組HIF-1α、TLR4灰度值比較 試驗組HIF-1α、TLR4灰度值均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表1。采用Pearson相關(guān)性分析，試驗組中HIF-1α、TLR4表達呈顯著正相關(guān)性（r=0.907，P<0.01），見圖5。

3 討論

HIF-1由Semenza等[7]于1992年在缺氧環(huán)境培養(yǎng)下細胞的核提取物中首次發(fā)現(xiàn)，隨后不久其分子結(jié)構(gòu)鑒定為異源二聚體，由分子量120 kD的HIF-1α和91/93/94 kD的HIF-1β兩個亞單位組成。HIF-1α與HIF-1β均為基本的螺旋-環(huán)-螺旋（basic-helix-loop-helix，bHLH）轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，具有Per-AHR/ARNT-Sim（PAS）結(jié)構(gòu)域。HIF-1α是保證缺氧誘導(dǎo)蛋白HIF-1穩(wěn)定性、決定表達水平、維持生物活性所必需的亞基，具有低氧依賴性，而HIF-1β僅僅起到結(jié)構(gòu)性作用并且表達水平穩(wěn)定[8]。當細胞內(nèi)環(huán)境出現(xiàn)缺氧信號時，HIF-1α分解受抑制，HIF-1生物活性增強。HIF-1α與HIF-1β聚合成大量HIF-1分子，進入細胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子協(xié)調(diào)作用，調(diào)節(jié)缺氧相關(guān)基因及靶向基因的表達，使細胞適應(yīng)缺氧，并維持代謝、增殖、誘發(fā)炎癥反應(yīng)等。近年來發(fā)現(xiàn)鼻息肉患者常常合并竇口-鼻道復(fù)合體解剖學(xué)結(jié)構(gòu)異常，如中鼻道狹窄、鼻甲肥大、竇口堵塞，并且息肉往往起源于中鼻道及鼻竇腔。Tos等[9]認為中鼻道的血流量較其他部位低，息肉組織中血流量更低，缺氧環(huán)境可能是鼻息肉發(fā)生的孵育器。與缺氧環(huán)境關(guān)系最為密切的細胞因子是HIF-1α，Chien等[10]通過RT-PCR和免疫組織化學(xué)染色來檢測鼻息肉組織和正常下鼻甲黏膜中的HIF-1α表達情況，推測出HIF-1α高水平表達可加重炎癥反應(yīng)及組織水腫、細胞缺氧損傷并導(dǎo)致鼻息肉形成。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，當組織處于缺氧環(huán)境下，HIF-1α也可通過PI3K/Akt通路的激活來提高表達水平同時促進一氧化氮合酶的生成，使下游靶基因產(chǎn)物VEGF表達增多，從而誘發(fā)組織水腫及趨化炎性細胞浸潤[11-15]。楊琳紅[16]通過建立無血清原代人鼻黏膜上皮細胞培養(yǎng)體系及低氧體系，運用原位雜交及Western Blot對HIF-1α及其靶向產(chǎn)物進行檢測，肯定了HIF-1α對鼻息肉發(fā)生、發(fā)展中的意義。在本項研究中發(fā)現(xiàn)，HIF-1α蛋白表達水平在試驗組較健康對照組升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），提示HIF-1α在鼻息肉發(fā)生發(fā)展中有著重要的促進作用。再次證實了鼻息肉組織中缺氧環(huán)境的存在，HIF-1α的過表達促進了鼻息肉的產(chǎn)生。

TLR4是固有免疫防御體系中重要的模式識別受體，其配體主要為人體致病微生物細胞壁成分，表達在免疫組織及細胞表面[17]。屬于經(jīng)典Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)組成。胞外區(qū)由富亮氨酸的氨基酸重復(fù)序列構(gòu)成，結(jié)構(gòu)域呈馬蹄狀，與配體結(jié)合的重要結(jié)構(gòu)。跨膜區(qū)及胞質(zhì)區(qū)主要發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。當受體與配體結(jié)合后，可激活MyD88信號通路，分泌各種細胞因子、啟動免疫細胞應(yīng)答、誘發(fā)炎癥反應(yīng)以消滅入侵致病微生物。同時在TLR4信號通路下游有NF-κB因子，主要介導(dǎo)免疫因子及炎性因子的表達調(diào)節(jié)，有研究發(fā)現(xiàn)其與炎癥瀑布效應(yīng)及免疫失控自身損傷關(guān)系密切[18]。大量資料顯示鼻息肉患者鼻腔分泌物及術(shù)中黏膜取樣G-細菌、真菌等病原體檢出率較高。王成碩等[4]首次使用原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)TLR4mRNA在鼻息肉組織中表達較高與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，論證鼻息肉發(fā)病過程感染因素的存在。病原體感染可導(dǎo)致鼻息肉發(fā)病已是不爭的事實。國外用特殊感染病原體誘發(fā)呼吸道上皮細胞TLR4高表達，呼吸道炎癥反應(yīng)明顯、細胞損傷較重，抑制TLR4表達后減輕了上皮細胞損傷，認為TLR4異常表達對機體不利[19]。顧兆偉等[20]采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測鼻息肉組織中TLR4蛋白表達，TLR4 表達水平與炎癥、病變程度大致呈正相關(guān)，提示TLR4高表達可能與鼻息肉形成有關(guān)。Cho等[21]證實細菌細胞壁脂多糖可通過TLR4觸發(fā)免疫應(yīng)答激活MAPK和PI3K/Akt信號通路參與鼻息肉組織的重塑，進一步論證TLR4的異常表達可參與鼻息肉的形成。本研究中TLR4在試驗組表達水平明顯高于對照組（P<0.01），鏡下可見鼻息肉組織中大量炎癥細胞浸潤、組織水腫嚴重與先前研究結(jié)果基本保持一致，可以推測出雖然TLR4作為機體固有免疫防線，但是在表達高度上調(diào)發(fā)揮免疫防御角色時，也誘發(fā)了鼻黏膜持續(xù)炎癥反應(yīng)及損傷，最終可誘發(fā)鼻息肉形成。endprint

HIF-1α與TLR4在鼻黏膜息肉病變發(fā)生機制上的研究仍尚不明朗。筆者采用Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)鼻息肉組織中HIF-1α、TLR4表達呈高度正相關(guān)性（r=0.907，P<0.01）。之前有研究證實當抑制鼻息肉組織TLR4表達后，HIF-1α的靶向產(chǎn)物表達受抑制[22]。結(jié)合本次研究結(jié)果可以推測出HIF-1α與TLR4之間可能存在交叉對話，它們共同促進了鼻息肉的形成與發(fā)展，但具體機制尚待進一步研究證明。

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（收稿日期：2017-09-25） （本文編輯：程旭然）endprint