結(jié)腸癌中p—mTOR、p—p70S6K的表達(dá)與臨床病理意義

趙溢斐+周逢強(qiáng)+徐宏

【摘要】 目的：探討磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）及其下游因子p-p70S6K在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況，分析其與臨床病理特征的關(guān)系。方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)結(jié)腸癌組織、癌旁組織、正常結(jié)腸組織中p-mTOR、p-p70S6K的表達(dá)。結(jié)果：81例結(jié)腸癌組織中p-mTOR表達(dá)率為51.85%（42/81），顯著高于正常結(jié)腸組織的21.74%（5/23）、癌旁組織35.80%（29/81），且p-mTOR的表達(dá)與TNM分期、結(jié)腸癌解剖位置相關(guān)（ 字2=7.617、5.358，P<0.05）。p-p70S6K在結(jié)腸癌的表達(dá)率為72.84%（59/81），且與p-mTOR的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.356，P=0.001）。結(jié)論：p-mTOR、p-p70S6K蛋白在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，且與結(jié)腸癌的發(fā)生、解剖部位、TNM分期有關(guān)，可作為結(jié)腸癌診斷和預(yù)后判斷的指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】 p-mTOR； p-p70S6K； PI3K/AKT通路； 結(jié)腸癌

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of mammalian target of rapamycin pamptomycin target protein（p-mTOR） and its downstream factor p-p70S6K in colonic carcinoma，and to analyze its relationship with clinicopathological features.Method：The p-mTOR and p-p70S6K expression was detected in normal，adjacent，and colonic carcinoma tissues using immunohistochemical method.Result：The expression rate of p-mTOR in 81 cases of colonic carcinoma was 51.85%（42/81），which was significantly higher than that in normal tissues（21.74%，5/23） or adjacent tissues（35.80%，29/81），and the expression of p-mTOR was correlated with TNM stage and colonic carcinoma location（ 字2=7.617，5.358，P<0.05）.The expression rate of p-p70S6K in colonic carcinoma was 72.84%（59/81） and was positively correlated with the expression of p-mTOR（r=0.356，P=0.001）.Conclusion：p-mTOR，p-p70S6K protein is highly expressed in colorectal cancer tissues and is related to the occurrence，anatomical site and TNM staging of colon cancer，which can be used as an index for the diagnosis and prognosis of colon cancer.

【Key words】 p-mTOR； p-p70S6K； PI3K/AKT pathway； Colorectal cancer

First-authors address：Binzhou Medical University，Yantai 264003，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.02.011

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，多種信號(hào)通路匯聚于上，作為多種通路的中心環(huán)節(jié)，mTOR整合上游的信號(hào)和能量，控制基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成，并且在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、血管生成、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及化療耐藥中也發(fā)揮了重要作用[1-4]。核糖體S6蛋白激酶（P70S6K）為mTOR下游因子，在蛋白質(zhì)翻譯的延長(zhǎng)階段能加快翻譯速度，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。p-mTOR、p-p70S6K分別是mTOR、p70S6K其磷酸化形式。研究表明，p-mTOR、p-p70S6K在多種實(shí)體腫瘤中異常表達(dá)[5-7]。因此，本實(shí)驗(yàn)以PI3K/AKT通路中的兩個(gè)重要蛋白p-mTOR和p-p70S6K為觀察指標(biāo)，通過(guò)檢測(cè)結(jié)腸癌組織、癌旁組織、正常結(jié)腸組織中上述蛋白的表達(dá)情況，探討兩者對(duì)結(jié)腸癌病理參數(shù)的影響并驗(yàn)證兩者表達(dá)的相關(guān)性。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 選取濱州市人民醫(yī)院胃腸外科2016年2月-2017年2月結(jié)腸癌根治術(shù)病理標(biāo)本共81例，所有病例術(shù)前均無(wú)化療、放療、靶向治療及免疫治療史。其中男45例，女36例；年齡33～81歲，平均62歲；其中右半結(jié)腸37例，左半結(jié)腸44例；腫瘤直徑>3 cm 53例，腫瘤直徑≤3 cm 28例；按照TNM臨床分期標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ期11例，Ⅱ期27例，Ⅲ期38例，Ⅳ期5例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移57例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移5例，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移76例。同時(shí)取81例距腫瘤邊緣5 cm以遠(yuǎn)的癌旁結(jié)腸組織、23例外傷患者的正常結(jié)腸組織作為對(duì)照。

1.2 主要試劑 p-mTOR兔抗人多克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，p-p70S6K兔抗人多克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，檸檬酸抗原修復(fù)液、磷酸鹽緩沖液（PBS）及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司。endprint

1.3 試驗(yàn)步驟 所有標(biāo)本離體常規(guī)固定、脫水及石蠟包埋行厚4 μm連續(xù)切片，用Envision二步法免疫組化染色，p-mTOR、p-p70S6K一抗的工作濃度為1∶100，常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、檸檬酸鹽緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)，一抗和二抗分別孵育、二氨基聯(lián)苯胺顯色、蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片觀察。用已知陽(yáng)性的切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖溶液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) p-mTOR蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，部分位于細(xì)胞膜，陽(yáng)性者細(xì)胞質(zhì)可見黃色顆粒，p-p70S6K蛋白定位在細(xì)胞核，陽(yáng)性染色為棕黃色或棕褐色顆粒樣物質(zhì)。每個(gè)標(biāo)本至少計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，基于染色強(qiáng)度和p-mTOR陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度：0分（無(wú)染色）、1分（弱染色）和2分（強(qiáng)染色），用染色強(qiáng)度乘以陽(yáng)性細(xì)胞所占的比例，≤20為陰性，>20為陽(yáng)性[8]。以上結(jié)果均至少由兩位病理科醫(yī)生以雙盲法觀察確定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料以率表示，多組比較采用 字2檢驗(yàn)，多組間兩兩比較的顯著性水平經(jīng)Bonferroni校正，相關(guān)性采用Spearman檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p-mTOR蛋白在結(jié)腸癌中的表達(dá)及與病理參數(shù)的關(guān)系 p-mTOR在正常組織、癌旁組織、癌組織中的表達(dá)率分別為21.74%（5/23）、35.80%（29/81）、51.85%（42/81），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=8.370，P<0.05）。結(jié)腸癌中p-mTOR陽(yáng)性率高于正常組織（ 字2=6.558，P<0.05），癌旁組織和正常組織無(wú)明顯差異（P>0.05）。在臨床病理參數(shù)中，p-mTOR蛋白表達(dá)率與TNM分期、結(jié)腸癌解剖位置相關(guān)（ 字2=7.617、5.358，P<0.05），但與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（ 字2=2.026、2.138，P>0.05）。見表1、2及圖1。

2.2 p-p70S6K蛋白在結(jié)腸癌中的表達(dá)及與病理參數(shù)的關(guān)系 p-p70S6K在正常組織及癌組織中的陽(yáng)性率分別為38.10%（8/21）、56.79%（46/81）、72.84% （59/81），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=10.036，P<0.05）。結(jié)腸癌中p-p70S6K陽(yáng)性率高于正常組織（ 字2=8.932，P<0.05），癌旁組織和正常組織無(wú)明顯差異（P>0.05）。在臨床病理參數(shù)中，p-p70S6K表達(dá)率與TNM分期、結(jié)腸癌解剖位置均相關(guān)（ 字2=7.675、6.164，P<0.05），但與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=3.244、2.277，P>0.05）。見表1、2及圖2。

2.3 p-mTOR與p-p70S6K表達(dá)的相關(guān)性 在81例結(jié)腸癌組織中，p-mTOR陽(yáng)性表達(dá)42例中，p-p70S6K蛋白有陽(yáng)性表達(dá)占37例，而p-mTOR表達(dá)陰性的39病例中，p-p70S6K蛋白陰性的占17例。經(jīng)Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，顯示p-mTOR及p-p70S6K蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.356，P=0.001）。

3 討論

信號(hào)通路的異常活化與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。PI3K/AKT在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著抑制凋亡，促進(jìn)增殖的作用。研究表明，PI3K/AKT通路在正常組織中處于失活狀態(tài)，但在腫瘤組織中會(huì)異常激活[9]。PI3K/AKT通路的激活將賦予腫瘤細(xì)胞巨大的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，使蛋白質(zhì)合成量增加，同時(shí)抑制自噬，使得腫瘤細(xì)胞即使以高速增殖，也不易凋亡[10]。

mTOR是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的在進(jìn)化上高度保守的蛋白激酶，其基因定位于1號(hào)染色體短臂，與細(xì)胞的凋亡、增殖、遷移、周期調(diào)控均密切相關(guān)。mTOR作為PI3K/AKT通路的下游蛋白，以其磷酸化形式p-mTOR在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮活性[11]。然而，PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，并未增加mTOR蛋白表達(dá)量，而是促進(jìn)mTOR的磷酸化，在現(xiàn)有mTOR蛋白的基礎(chǔ)上提高p-mTOR的占比[12]。所以，針對(duì)p-mTOR蛋白的研究更能反映出該通路在細(xì)胞內(nèi)的激活程度。Cao等[13]發(fā)現(xiàn)p-mTOR在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織和癌旁組織。Murayama等[14]發(fā)現(xiàn)，胃癌中p-mTOR的表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)受累、TNM分期均呈正相關(guān)。Gille等[15]證實(shí)，p-mTOR能作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，選擇性激活VEGF（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子），誘導(dǎo)血管生成，保障實(shí)體腫瘤的血供，為血行播散提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Melling等[16]發(fā)現(xiàn)p-mTOR在左半結(jié)腸癌的表達(dá)率顯著高于右半結(jié)腸癌，并推測(cè)其與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）及遺傳性非息肉病結(jié)腸癌綜合征（HNPCC）在左半結(jié)腸癌中的發(fā)生率較低有關(guān)。Ueng等[17]研究表明p-mTOR與乳腺癌的生存期相關(guān)。這提示p-mTOR的表達(dá)可能對(duì)結(jié)腸癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移、分化程度及遠(yuǎn)期預(yù)后均有一定影響。

在體內(nèi)p-mTOR通過(guò)磷酸化多種蛋白來(lái)發(fā)揮其生理作用，p70S6K則是其最重要的底物之一。p70S6K存在于mRNA的5帽端，p-mTOR磷酸化其T389位點(diǎn)使其激活。研究表明，p-p70S6K能激活細(xì)胞周期依賴性蛋白激4（CDK4）[18]、細(xì)胞周期素（Cyclin）[19]，加快細(xì)胞分裂G期進(jìn)展，縮短細(xì)胞周期，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。Wang等[20]發(fā)現(xiàn)，p-p70S6K作用于真核生物延長(zhǎng)因子2（eEF2）、細(xì)胞程序性死亡蛋白（PDCD4）提高mRNA的翻譯速度，促進(jìn)腫瘤的增殖。Park等[21]證實(shí)，p-p70S6K可促進(jìn)肌動(dòng)蛋白細(xì)絲重構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

在本實(shí)驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)p-mTOR、p-p70S6K蛋白在結(jié)腸癌中的表達(dá)率顯著高于正常結(jié)腸組織、癌旁組織（P<0.05），說(shuō)明結(jié)腸癌發(fā)生與p-mTOR、p-p70S6K蛋白關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，p-mTOR、p-p70S6K蛋白的表達(dá)與TNM分期密切相關(guān)，但與腫瘤的直徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，這與Murayama等[14]的結(jié)果有一定的差異，可能是標(biāo)本組織的來(lái)源不同導(dǎo)致的腫瘤生物學(xué)行為的差異。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者發(fā)現(xiàn)p-mTOR在左半結(jié)腸癌的表達(dá)率顯著高于右半結(jié)腸癌，但具體機(jī)制目前不甚明了，Melling等[16]曾推測(cè)其與微衛(wèi)星不穩(wěn)定有關(guān)，但目前尚缺乏實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，有待進(jìn)一步研究。endprint

本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究參與結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等的具體機(jī)制提供了一定的研究思路，同時(shí)聯(lián)合檢測(cè)結(jié)腸癌中p-mTOR及p-p70S6K蛋白的表達(dá)有利于了解結(jié)腸癌的生物學(xué)行為，為結(jié)腸癌的早期診斷、靶向治療、預(yù)后判斷提供了一個(gè)有效的靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2017-09-25） （本文編輯：程旭然）endprint