符合工程化需求的生物元件設計

崔穎璐 吳 邊

中國科學院微生物研究所 微生物資源前期開發國家重點實驗室 生理與代謝工程重點實驗室 北京 100101

2000 年，以撥動開關（toggle switch）與合成振蕩器（synthetic oscillator）為標志的基因設計研究使合成生物學走進了人們視野[1,2]。近年來，隨著合成生物學的蓬勃發展，人們很快認識到，生物系統可以在定量模型指導下，用“模塊化、標準化”的組成單元來設計構建人工復雜系統。其中，生物元件作為合成生物學三大基本要素之一，對其進行深入挖掘和改造已成為合成生物學領域的重要研究方向。為了方便利用模塊化、標準化的“部件”拼裝“機器”，2003 年，美國麻省理工學院相關合成生物學實驗室成立了標準生物元件登記庫（Registry of Standard Biological Parts，http://partsregistry.org），收集滿足標準化條件的生物元件。截至 2018 年已有超過 20 000 個生物元件被登記，其中包括啟動子、轉錄單元、質粒骨架、蛋白質編碼區等 DNA 序列，以及核糖體綁定位點、終止子等 RNA 序列和蛋白質結構域。

天然生物元件來源于自然進化，在模塊化、組裝、集成等方面，難以符合特定工程需求。如果將細胞看成合成工廠，由 DNA 編碼的蛋白質和 RNA 等轉運、調控、催化基本元件在生命體系中體現出一定的交互性和模塊性。如何讓不同單元之間、單元與途徑和網絡之間可控、可組裝，是工程化設計創建生物系統首要面臨的問題。目前，大量已知功能的生物元件并未被標準化，許多元件體現出不兼容性，加之整合過程中的復雜性和整合后的可變性等因素，導致元件之間不能協調一致地工作，效率大幅降低，或無法實現設計功能。因此，設計具有良好協調行為、協同執行功能的生物系統是合成生物學的一項重大挑戰，也是解決“人造生命”的重要突破口。本文簡要介紹了近年來非催化元件的研究現狀，重點介紹催化元件設計領域從頭預測新酶結構的分子優化設計、人工金屬催化酶設計、底物選擇性重設計以及酶分子熱穩定性設計 4 個方面的前沿研究進展，并綜述了酶分子設計與工業生產的跨層次結合與技術互融，以期為合成可控、功能特定的人工生物體系提供重要線索，同時有助于推動合成生物學關鍵基礎技術體系與工業生物過程的互作發展。

1 非催化元件設計的研究進展

自 2005 年啟動子庫被引入精細調控代謝途徑理念后，多種宿主細胞（如大腸桿菌、酵母菌以及放線菌等）啟動子庫相繼被開發和被設計。隨著大數據和人工智能技術的發展，針對特定需求啟動子序列，借助人工神經網絡系統及計算機輔助設計，人工設計預測模型的訓練集與測試集回歸相關系數可達到98%[3]。英國劍橋大學的 Rackham 與 Chin[4]利用篩選法獲得了正交的核糖體 RNA-mRNA 正交對。在細胞內，只有當兩者都表達時，核糖體才能正常地識別特定的 mRNA 而產生功能蛋白。同時，他們還利用不同的正交對拓撲結構構建了更多翻譯水平的邏輯門，為人工設計與宿主遺傳背景正交的遺傳線路奠定了基礎。

目前，在生物元件方面已完成了多種不同來源的啟動子、核糖體結合位點與終止子元件庫的構建及預測設計，實現了強度跨度大、梯度密集的元件庫。此外，越來越多新穎的元件不斷被開發，如核酸開關（riboswitch）、核酸調節子（riboregulator）等順式作用元件，以及轉錄激活樣效應子（transcription activated-like effector，TALE）、CRISPR/Cas9 系統等反式元件，為代謝平衡優化與復雜遺傳環路設計提供了堅實保障。如果將非催化元件作為“基礎工具”，那么催化元件可看做“功能工具”，對實現代謝途徑高效運行具有至關重要的作用。

2 催化元件設計的國際前沿進展

催化元件是合成生物學研究中重要的基本生物元件。雖然在人工合成途徑組裝中可以跨物種應用天然酶資源來重構特定的代謝途徑，但由于自然界的固有催化特征體系，人工合成往往無法滿足合成生物學的一些特殊要求，如在異源宿主中表達量低、生理條件不適應、上下游酶活性不匹配等。因此，通過對催化元件的人工設計和組裝來提供具有新功能的元件成為人工合成途徑構建的基礎。

目前，利用定向進化策略提高催化元件活性、穩定性等方面已經獲得一定成效。但由于突變體文庫構建數量龐大，并需多輪進化，因而定向進化策略難以完成對序列空間的全面搜索。除此之外，突變技術中固有的密碼子簡并性和堿基突變傾向性使突變文庫多樣性受到極大限制。隨著高性能計算技術發展，計算蛋白質設計技術取得了前所未有的發展，尤其在核心元件酶催化設計方面發揮出巨大作用。利用計算蛋白質設計可根據反應特性以及底物結構等特定研究，定向改造催化元件，并建立全面搜索高精度智能化文庫。這極大程度降低了定向進化策略龐大突變體文庫所需的材料成本、時間成本及人力成本[5]。2016 年，Nature 雜志發表了題為《全新蛋白質設計時代來臨》的重要綜述[6]。同年，Science 雜志也將蛋白質計算機設計遴選為年度十大科技突破之一。2017 年，美國化學會將人工智能設計新型蛋白質結構列為化學領域八大科研進展之首[7]。通過高精度、高效計算模擬技術，蛋白質分子結構、功能設計極大程度擴展了人工改造生命體的應用場景，為現代生物制造帶來全新發展機遇。針對酶的催化功能特性，目前催化元件的計算設計研究主要涵蓋基于結構的從頭預測酶分子及后續優化設計，基于催化底物的立體選擇性及位置選擇性設計，基于金屬催化特性的金屬酶設計，以及基于功能特性的熱穩定性設計等領域。

2008 年，華盛頓大學 Baker 團隊提出從內而外的“Inside-out 策略”，并應用該策略設計改造了逆醛醇縮合酶[8]、Diels-Alder 反應催化酶[9]、Kemp 消除催化酶[10]等一系列酶。然而，盡管從頭計算新酶設計已取得一定成功，“Inside-out 策略”依然存在不同層面的缺陷：① 策略中的模型——theozyme，不能完全反映酶催化過程的真實過渡態；② 新酶設計需要將催化活性中心與蛋白質骨架進行嵌合，而嵌合過程難免會影響蛋白質的結構和穩定性；③ 在計算過程中并未考慮長程靜電相互作用及蛋白骨架“誘導-契合”的變構影響，經過循環設計和結構優化后獲得的酶分子構象非常容易陷入能量勢阱，在相鄰位置可能存在其他極小值。因此，基于“Inside-out策略”設計的少數具有預期功能的新酶分子初始活性相對較低，需要通過進一步改造來提高酶學屬性。

隨著量子力學和分子動力學理論及方法學的發展，計算精度不斷提升，計算尺度逐步擴大，相關算法的通量、靈敏度、選擇性等也有大幅提高。因而，利用量子力學/分子動力學以及大數據分析方法可以快速定位特定功能區和協同進化位點，為合成生物學功能器件提供大量精確模板和互作模型。在基于“Inside-out 策略”獲得的新酶基礎上進一步推動催化元件活性大幅提升，使酶工程技術迎來發展新階段，同時也為發展符合工程化需求的生物元件設計提供指導規律。

2.1 從頭預測酶分子優化設計

通過分子動力學（molecular dynamics，MD）模擬、量子力學/分子力學（quantum mechanics/molecular mechanics，QM/MM）聯用方法對酶分子催化機理分析，以及對蛋白質骨架結構進行進一步修飾可大幅提高基于從頭預測方法獲得新酶分子的催化活性。例如，在 Kemp 消除反應酶分子設計中，羧酸基團作為廣義堿與非極性底物間相互作用。但是由于羧酸基團自由度較大，如果不能準確計算羧酸基去溶劑化效應的能量消耗及熵減，可能使羧酸基團失去廣義堿功能從而導致反應無法進行。Warshel 課題組通過 QM/MM 經驗價鍵（empirical valence bond，EVB）方法預測高活性 Kemp 消除反應突變體，其結果與實驗值比較一致，但與實驗速率常數推導出的能壘的相關性較弱[11]。Mayo 課題組計算迭代方法，以非活性蛋白質支架 HG-1 為起始點計算，迭代校正后獲得的 8 種設計酶均表現出顯著的催化活性，大幅提高了計算設計酶分子的成功率[12]。

Diels-Alder 反應是雙分子成環反應，自然界中并未發現能夠催化該反應的天然酶分子。2010 年，Baker 研究團隊通過“Inside-out 策略”設計了 84 個可能具有 Diels-Alder 反應催化活性的蛋白，實驗驗證后僅余兩個蛋白（DA_20 和 DA_42）具有 Diels-Alder 反應催化活性[9]。隨后，Baker 團隊通過 Foldit 在線蛋白質折疊游戲對從頭設計的 Diels-Alder 催化酶引入骨架活性以改善骨架結構問題。多名在線貢獻者重塑 DA_20 骨架，使底物與蛋白骨架充分適應調整，從而將 Diels-Alder 催化酶活性提高至少 18 倍[13]。2012 年，Roelfes 課題組在轉錄因子 LmrR 孔道末端引入半胱氨酸，共價連接含有鄰菲羅啉或聯吡啶基團的小分子進而與 Cu(Ⅱ) 配位，設計出的人工金屬酶具有 97% 的對映選擇性[14]。

2.2 人工金屬催化酶設計

金屬酶在原子轉移反應中占有重要地位。自 21 世紀初開始，人工金屬酶設計迅速發展，并從水解反應等天然催化反應擴展至碳-碳鍵連接、氧轉移反應等非天然酶催化原子轉移反應。例如，上述的 Diels-Alder 反應中，人工金屬酶催化 Diels-Alder 反應的立體選擇性和反應活性已與化學催化劑相當。此外，相對于天然酶，金屬酶的底物范圍明顯增大[15]。2011 年，Kuhlman 課題組偶然發現，在同源二聚體界面處計算設計的 Zn(Ⅱ) 結合位點可有效催化羧酸酯和磷酸酯水解[16]。隨后，他們在 rabenosyn 蛋白的 Rab4 結合域引入組氨酸與 Zn(Ⅱ) 配位，該復合體對 4- 硝基苯基乙酸酯的水解速率提升了 5 個數量級[17]。除了活性位點結構優化外，化學連接法也是人工金屬酶設計的可行策略。Rovis 課題組讓生物素 Rh(Ⅲ) 配位復合物與鏈霉親和素結合，構建出用于活化 C-H 鍵的人工金屬酶，催化速率提升了100 倍，并具有 93% 的對映選擇性[18]。此外，正如 Alexandrova 課題組在綜述中所述，金屬酶進化過程除了受反應活性等因素影響外，還受金屬可用性和毒性影響[15]。在這些限制因素下，金屬催化劑并非一定達到其最佳催化性能。因此，利用新型金屬代替固有金屬催化劑改善酶的催化性質為金屬酶分子設計提供了新思路。Itoh 和 Fujieda[19]在分子動力學模擬的基礎上，利用銅離子取代 β- 內酰胺酶的雙鋅離子結合部分，制備了人工雙銅氧化酶。與野生型 β- 內酰胺酶相比，這種銅取代氧化酶的三重突變體催化 4- 叔丁基羧酸酯的 kcat/KM值增加了 87 倍。

2.3 底物選擇性重設計

酶催化中心的精確空間結構賦予其高度的底物特異性等特點。面對紛繁龐雜的底物譜，從自然界中篩選新酶開發的速度遠不能滿足當今合成生物學需求，因此改變酶的底物特異性是計算蛋白質設計中應用最廣泛的方向之一[20]。

2015 年，Baker 課題組通過計算設計聚甲醛酶，將單碳甲醛分子固定至三碳單元的二羥基丙酮中，從而實現核心代謝步驟，首次通過催化元件設計指導新型代謝通路合成[21]。他們以苯甲醛裂解酶（benzaldehyde lyase，BAL）為起點，利用 RosettaDesign 以及 Foldit 重新設計 BAL 的苯甲醛結合口袋以增加其對甲醛的特異性，獲得 7 個突變氨基酸組成的聚甲醛酶（Formolase，FLS）。該酶對聚甲醛反應的催化效率與原始 BAL 相比增加 100 倍。在甲酸轉化為二羥丙酮磷酸鹽途徑中，由甲酸直接還原為甲醛難度很大。為實現甲酸轉化，Baker課題組先將甲酸活化為甲酰基 -CoA，降低熱力學障礙。隨后通過 BRENDA 數據庫搜索挖掘能夠將甲酰基 -CoA 還原為甲醛的酰化醛脫氫酶，并將乙酰輔酶 A 合酶與酰化醛脫氫酶串聯催化甲酸轉化為甲醛。通過上述設計的聚甲醛酶，將甲酸最終轉化為磷酸二羥丙酮。這項工作充分證明了酶分子底物重設計能夠有效引導新型代謝途徑設計。

2.4 酶分子熱穩定性設計

改善酶熱穩定性可提高異源宿主表達量，提高溫和條件下催化元件活性，并增強酶對嚴苛工業條件（有機溶劑、高溫、極端 pH 值等）的耐受力。在蛋白質熱穩定性改造方面，使用傳統蛋白質進化的方法，蛋白質熔解溫度的提高通常小于 15℃。而通過對蛋白質整體結構的能量計算指導的計算機設計方法則可以突破該局限，甚至可以使蛋白質的熔解溫度提高超過 35℃ 以上的水平，獲得具有超熱穩定性的蛋白[22]。

目前，針對酶分子熱穩定性改造已發展出多種策略和算法，其預測能量與數據庫值擬合程度最高相關系數（R 值）可達到 0.73（Foldx 程序）[23]。Weiss 團隊利用 SCADS 策略（Statistical, Computationally Assisted Design Strategy，SCADS）對馬兜鈴烯合成酶進行環境能量打分，檢測氨基酸側鏈與周圍骨架、側鏈，以及所在環境的相互作用[24]。通過環境能量評估篩選 12 個打分最高的氨基酸進行突變，熔融溫度由 38℃ 提升至 83℃。Janssen 課題組通過 FRESCO 策略（Framework for Rapid Enzyme Stabilization by Computational libraries，FRESCO）對檸檬烯環氧化物水解酶進行熱穩定性突變體文庫構建，通過結合 10—12 個單點突變，組合突變體的熔融溫度從 50℃ 提高至 85℃，且酶的催化活性增強，半衰期延長大于 250 倍[25]。他們還利用 FRESCO 策略對鹵代烷脫鹵酶（haloalkane dehalogenase）LinB 進行熱穩定性計算。12 個穩定突變疊加導致 LinB 突變體熔融溫度增加 23℃，并且在 60℃ 下半衰期超過 200 倍[26]。此外，為了提高鹵代醇脫鹵素酶（halohydrin dehalogenase）在有機溶劑中的耐受性，Janssen 課題組利用 FRESCO 策略確定了 218 個突變點和 35 個二硫鍵，具有預測的穩定效應。結果顯示，組合突變體（HheC-H12）熔融溫度提高 28℃，對共溶劑的抗性顯著增加[27]。2016 年，Fleishman 團隊開發了一種聯合計算策略（protein repair one stop shop，PROSS），設計帶有 51 個突變的乙酰膽堿酯酶（hAChE）突變體，通過結構分析發現該突變體可以顯著改善蛋白質的核心堆積、表面極性及骨架剛性[28]。與野生型相比，該突變體在大腸桿菌中表達水平高出 2 000 倍，熱穩定性提高 20℃。

多肽的末端功能化對蛋白質生化性質具有非常重要的影響。通過對 C 端的特異性修飾可以使多肽的體內代謝半衰期延長、免疫原性降低或毒副作用減少。由于多肽結構的復雜性，化學修飾步驟多、產率低、難度很大。2016 年，中國科學院微生物研究所研究團隊與荷蘭格羅寧根大學以及 Enzypep 公司合作，采取一種“FRESCO 與一致性分析聯合計算”策略對多肽酰胺酶進行了工程化改造，成功設計了一個經過高度改造的多肽酰胺酶突變體 PAM12A（包含 12 個突變點）。PAM12A 具有極高的熱穩定性（熔解溫度達到 76℃），并且可以在乙腈、丙酮等多種無水溶劑環境中保持數天的穩定活性[29]。實驗結果表明，PAM12A 可以催化包括甲酯化、羥胺化、甲胺化、胺化在內的多種不同的多肽修飾反應，且不受多肽本身序列和 C 端原功能基團的限制。

3 酶分子設計與工業生產的跨層次結合與技術互融現狀簡介

近年來，合成生物學的基礎理論研究及相關應用技術，如基因組測序技術、計算機設計技術等以指數增長的速率發展。值得注意的是發達國家在合成生物學知識產權領域十分活躍，連續申請了一系列覆蓋領域很寬的專利，阻止他人進入相關領域[30]。而我國在合成生物學方面的研究還處于起步階段，待解決的核心問題體現在先進的實驗室前沿技術與工業生產技術對接能力相對滯后，技術融合過程緩慢。諾維信公司（https://www.novozymes.com）作為工業用酶巨頭，在 2014 年占據了 44% 的市場份額，是全球工業酶制劑和微生物制劑市場的絕對領導者；而美國杜邦公司和荷蘭 DSM 公司分別占有 20% 和 6% 的市場份額。全球各地區對工業酶的需求也呈現巨大差異，歐洲和北美地區需求量最大，共占據 80% 市場份額；而中國僅占 9.4%[31]。隨著國家創新驅動發展戰略的深入實施，生物工業發展面臨重要發展機遇和投資前景。如何建立以合成生物學技術和生物-化學聯合技術為核心的低成本生物制造工藝路線，同時建立促進工業生物技術發展的關鍵技術體系，將研究機構的研究成果與工業生物過程同時兼顧是亟待解決的核心問題。

隨著先進制造產業涵蓋領域與發展規模日益擴大，生物及交叉應用領域不斷涌現出顛覆性創新應用，逐漸形成了產品多樣化、產出能力強、市場轉化活躍的產業技術創新體系。例如，β- 氨基酸具備多樣的特殊生物活性，被應用于醫藥、食品、農牧業等多個產業。β-內酰胺抗生素、重磅藥物紫杉醇（重磅抗癌藥物）、西格列汀（糖尿病藥物）及維生素 B5 等多種具有巨大市場銷售額的明星分子均需要 β- 氨基酸作為合成單元。長期以來，β- 氨基酸的合成一直依賴于過渡金屬催化的化學途徑，需要昂貴的催化劑、繁瑣的保護與去保護步驟以及苛刻的反應條件。而不對稱氫胺化反應具備極高的原子經濟性，無須附加其他輔劑，是美國化學會提出的最具“綠色化學和綠色工業”特性的十大反應之一[32]。然而，無論是人工設計的化學催化劑或是天然存在的生物催化劑都不能直接催化該反應。

中國科學院微生物研究所研究團隊通過 Rosetta Design 以及高通量 MD 模擬方法對天冬氨酸酶進行了分子重設計，成功獲得了一系列具有絕對位置選擇性與立體選擇性的人工 β- 氨基酸合成酶。該人工設計的反應體系體現了高效率、高原子經濟性等巨大優勢，底物濃度達到 300 g/L，實現了 99% 的轉化率，99% 區域選擇性，以及 99% 立體選擇性，相關指標達到了工業化生產的標準[33]。該項研究成果為人工智能技術在工業菌株設計方向的成功案例。除了在科學層面取得的重要進展，該團隊還積極推進科研成果的落地轉化，通過與企業的合作，該項技術已經通過中試與全尺寸生產工藝驗證，在近期完成了千噸級的生產線建設。相關產品有望在紫杉醇、度魯特韋與馬拉維若等抗癌，以及艾滋病治療藥物的生產過程中大幅降低生產成本。

4 結語

通過世界各國多個研究團隊的共同推動努力，催化元件設計已經從簡單的模式化學反應設計逐步向具有工業應用前景的催化途徑設計發展。除了可用于單一催化反應之外，通過將計算設計的酶整合入復雜途徑中，還可以創造出全新的代謝途徑，并生產出新型的化學分子。尤其是由計算推動的催化設計領域先導研究，可為合成生物學的發展提供自然界中本不存在的全新元件，進而極大擴展生命的可設計性，同時也為回答酶催化的本質機理以及蛋白質的基本折疊規律等重要基礎科學問題提供相應的支持。