基因組的設計與工程化構建

薛小莉 覃重軍

中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態研究所 中國科學院合成生物學重點實驗室 上海 200032

生命的起源是什么？最原始的生命是怎樣形成的？人類能否創造生命？從古至今，科學家和哲學家們一直在不斷探索并希望解決這些困惑。大量的微生物基因組序列的信息，以及各種組學的研究，包括基因組、轉錄組、蛋白質組、代謝組等，并由此構建出的調控網絡和代謝網絡模型，促進了我們對生命的理解，也讓我們意識到生命系統的復雜性。然而，在這些復雜的調控網絡和代謝途徑中，哪些是生存必需的呢？怎樣設計和構建一個簡約的生命體系呢？設計并構建簡約基因組將為合成生物學和人造生命的研究提供一個重要的基礎。

2010 年美國科學家 Venter 和他的科研團隊發表了世界上首個由化學合成基因組控制的原核生物支原體[1]。在此基礎上，他們通過大量的設計與測試，構建了目前已知的基因組最小的支原體[2]。與國際合成生物學的迅猛發展相比，我國的合成生物學研究起步較晚。2011 年，我國啟動了 10 項合成生物學相關的“973”項目，極大促進我國在人工生物體系的設計和合成，細胞生長功能群的模塊化及可控運行，發展重構、編輯簡小基因組，以及在底盤細胞上“即插即用”型地高效組裝生物學模塊的合成生物學使能技術等方面的研究，并取得了較好的進展。我國科學家（主要是天津大學、清華大學和深圳華大基因研究所的科學家）與美國等國家的科研機構共同推動了“酵母基因組合成國際計劃”，并于 2017 年完成了其中 4 條染色體的從頭設計與全合成[3-6]，這標志著中國的基因組設計合成能力達到了國際水平。2018 年，中國科學院合成生物學重點實驗室覃重軍研究團隊與合作者通過大膽假設驅動與合成生物學工程化的方法，將釀酒酵母的 16 條染色體融合為 1 條，創建了國際上首例單條染色體的真核細胞[7]。這一成果完全由中國科學家獨立完成，是合成生物學具有里程碑意義的重大突破。

近年來技術的發展，使得 DNA 合成成本降低，尤其是關鍵的 DNA 大片段拼接以及基因組轉移技術的進步，使得從頭全合成和拼接完整的微生物基因組獲得了成功，為人工合成生命細胞打破了技術屏障。人工合成生命細胞對于理解生命的本質和發展改造生命具有重要的意義。

1 人工設計與合成小基因組原核細胞

Venter 研究組于 2010 年報道了人工全合成和組裝 1.08 Mbp 的絲狀支原體 JCVI-syn1.0 基因組，并將其移植到受體山羊支原體細胞，創造出新的細胞具有絲狀支原體細胞的信息和特征[1]。這是一個龐大的工程，參與該項目有 20 多人，歷經了 15 年，花費了 4 000 萬美元，從而最終完成了這一重大的人工合成基因組的任務。在全基因組合成和拼接中，需要多級的質量監控，以保證合成出來的基因組序列的精確性。例如，Venter 團隊曾經因為一個堿基的錯誤而使得細胞不能存活——在調控染色體復制的生存必需基因 dnaA 中的一個堿基缺失造成基因的讀碼框移位，一個小的錯誤曾經耽誤了他們不少的時間。這個例子表明細胞的存活是需要精確調控的。Venter 等人合成的基因組幾乎跟天然的基因組一樣，要理解、設計和改造生命系統，僅僅拷貝并合成一個天然的小基因組是不夠的。

那么如何設計并合成一個比天然更小的基因組呢？Venter 團隊從全合成的生長比較快的 1.08 Mbp 的絲狀支原體 JCVI-syn1.0 基因組出發，通過多輪的設計—合成—測試，最后成功合成出了 531 kbp 且可存活的最小基因組的 JCVI-syn3.0[2]。這個 3.0 版本比天然最小的 583 kbp 的生殖道支原體基因組更小，生長卻是更快，代時僅有后者的 1/5。這被認為是接近于最小基因組的版本了。

這個成功的背后是超大量的設計、合成和測試工作。首先，他們發現基于已有知識設計最小基因組是不可行的。通過整合現有的轉座子突變和敲除數據，以及分子生物學累積的知識，從 1.08 Mbp 的絲狀支原體基因組 JCVI-syn1.0 中找到了可敲除的 440 個生存非必需基因，使得基因組減小到了 483 kbp。他們將這個預設的 483 kbp 的最小基因組分成 8 個大段，分別合成和測試功能。結果 8 個大段中僅 1 個大段是有功能的，但是該段的設計改造使得細菌生長很不好。導致前期的設計失敗的一個重要原因是在生存必需基因（e）及非必需基因（n）之間，還存在對生長重要的準-生存必需基因。根據準-生存必需基因對生長的影響情況，他們還分了非常影響生長的基因（ie）、影響生長的基因（i），以及輕微影響生長的基因（in）。他們認為應該保留生存必需的基因 e 以及影響生長的 ie 和 i，只把基本不影響生長的 in 和 n 作為敲除的備選基因。除了準-生存必需基因之外，還存在執行生存必需功能的冗余基因。比如，基因 A 和 B 都能執行生存必需功能 E，單敲除 A 或者 B 都不影響生存必需功能 E，那么我們一般會認為 A 和 B 都是生存非必需的。但是 A 和 B 的同時缺失將導致生存必需功能 E 的缺失而使得細菌不能存活。因此，需要大量的測試工作來尋找這些準-生存必需基因，以及執行生存必需功能的冗余基因。

值得注意的是，在基因組減小的過程中，基因組大小和生長速度之間有一個平衡。隨著基因組的減小，生長速度急速減慢。人工設計及合成出來的 531 kbp 支原體最小基因組 JCVI-syn3.0 代時為 180 min，比 1.08 Mbp 的支原體基因組 JCVI-syn1.0 的 60 min 的代時要慢很多。并且，它不像出發菌株那樣可以在液體培養基中形成均一的混懸液，而是容易沉淀。顯微鏡和電鏡下可以看到JCVI-syn3.0 細胞容易形成長的細絲狀的網絡結構，也會形成大的泡囊體。因此，這個接近于最小基因組的細胞的生長還是有缺陷的，不那么完美。但是，無論如何，這是一個成功設計與合成最小基因組的范例。

2 人工設計與合成原核模式生物大腸桿菌基因組

大腸桿菌是被最廣泛研究的原核模式生物。它生長快速，遺傳操作相對簡單——很多的遺傳操作技術都是首先在大腸桿菌中建立的。對大腸桿菌在組學水平的大量研究技術及生物信息學分析和建模促進了我們對大腸桿菌生物系統的理解，使我們能對大腸桿菌進行更有理性的改造，從而使它成為我們想要的超級菌株，以用于工業應用生產所需要的產物。基因組減小化可以降低基因組的復雜度，也減少了非必需的代謝途徑，有利于整合異源的高效生產元件以獲得高產的優化菌株。大腸桿菌的基因組有 4—5 Mbp，遠比 1 Mbp 的支原體基因組大。因此通過類似的“自下而上”從頭合成的方法來構建大腸桿菌簡約基因組并進行測試會很困難。因此，大部分與大腸桿菌減小基因組相關的研究報道都是通過“自上而下”的基因組刪減途徑來進行的。由于工業應用需求導向，我們希望構建的是具有快速生長、基因組穩定的大腸桿菌菌株。基因組的減小化與生長速度之間存在一定的平衡。因此，我們對大腸桿菌簡小基因組的研究并不是一味追求基因組的最小化，而是小而強大。

“自上而下”的基因組刪減策略是首先通過生物信息學方法分析生存必需基因[8]，比如，分析天然進化的含小基因組的微生物，或者用比較基因組學分析等。第二步是用高通量基因敲除方法鑒定生存必需基因。有了這些數據，我們可以確定基因組哪些區域是生存必需的，哪些區域是生存非必需的、可敲除的。通過對基因組中的生存非必需的區域進行大段刪減的測試，測試可敲除的區域再合并到一個菌株中，這樣可以逐步構建一系列基因組減小化的菌株。

目前主要有 3 類基因組減小的大腸桿菌菌株的構建[9]：① Delta 系列是通過大段敲除生存非必需區域，迅速將大腸桿菌基因組減小。但是由于沒有很理性的設計，最后構建出來的菌株存在生長缺陷。② 相比而言，MGF 系列只累積不影響生長的較小片段的敲除，因此最后構建出來的菌株生長狀況良好。③ MDS 系列著重敲除插入序列、原噬菌體等不影響生長且有助于基因組穩定的基因。因此，最后構建出來的菌株被認為是含有 clean genome（干凈的基因組）的，且菌株生長狀況良好。

2016 年，美國科學家 Church 研究組最近報道了全合成的密碼子簡約化的大腸桿菌基因組[9]。我們知道，1 個遺傳密碼子是由 3 個堿基組成，共有 64 個密碼子，除了 3 個終止密碼子外，其他 61 個密碼子對應于 20 種氨基酸。1 種氨基酸可以對應 1 到多個密碼子。全基因組范圍的同義密碼子置換可以構建具有遺傳隔離并具有新的生物功能的生命體。遺傳隔離是指由于新合成出來的生命體少了一些密碼子，使得外源 DNA，包括來源于病毒、質粒或其他細胞的 DNA，進入生物體內后可能無法正常表達，從而使生物體對感染和基因水平轉移不敏感。此外，可以利用置換出來的密碼子來表達 20 個氨基酸以外的非標準氨基酸，從而合成具有新化學活性的蛋白。Church 研究組通過重編程大腸桿菌基因組，將大腸桿菌基因組的 7 個密碼子，包括絲氨酸、亮氨酸、精氨酸的各 2 個密碼子以及 1 個終止子，用同義密碼子置換，從而將基因組使用的密碼子從 64 個降為 57個[9]。這是個很大膽的舉動，因為這 7 個密碼子的置換一共涉及了 6 萬多處改動。他們將大腸桿菌基因組分成 87 個約 50 kbp 的片段，并對其中的 55 個片段進行合成與分別測試。他們發現 91% 的生存必需基因在這樣的改動之后仍能保持功能且不影響生長。這表明了基因組的可塑性還是很大的。

3 人工設計與合成真核生物釀酒酵母基因組

釀酒酵母是最簡單的單細胞真核模式生物，對其基因組的重新設計及人工合成并進行功能研究將極大地推動人類對生命理解及改造能力。“釀酒酵母基因組合成計劃”（Sc2.0 項目）是人類首次嘗試改造和從頭合成真核生物。Sc2.0 項目是由美國科學院院士 Jef Boeke 發起，由多國研究機構參與并分工協作，對真核模式生物釀酒酵母 16 條染色體進行人工重新設計和化學再造，是繼原核支原體基因組合成項目之后，合成生物學領域的又一重大標志性國際合作項目。最先完成的是 3 號染色體的全合成與替換，2014 年在 Science 雜志報道[10]。2017 年，Science 雜志以封面、專刊的形式同時發表了介紹“人工合成酵母基因組計劃”已完成 2 號、5 號、6 號、10 號和12 號這 5 條染色體的從頭設計與全合成的研究，研究人員把經過設計的人工合成染色體導入釀酒酵母中，并保證帶有人工合成染色體的酵母菌仍能夠正常存活。我國天津大學、清華大學、華大基因研究院和 Boeke 院士一起合作，完成了其中 4 條染色體的全合成及功能驗證[3-6]，進一步證明了人工合成生命體系的可行性。對酵母 16 條染色體的人工設計內容，包括終止密碼 TAG 被 TAA 代替，引入了 loxP 重組位點可以允許基因組的快速改變，引入 PCR 檢測標記及限制性內切酶識別位點，以及敲除 tRNA 及重復序列等。這些設計及改變不會對酵母的生長有明顯的影響等。前期人工合成和構建的釀酒酵母染色體引入了很多 loxP 重組位點，誘導 Cre 切割 loxP 位點，任意兩個 loxP 重組位點之間的序列可以發生倒轉、缺失或重復。這個技術被稱為 SCRaMbLE，可以用于染色體快速重排。通過定向篩選，可以很快找到對微生物細胞工廠性能提升、生命快速進化和人類染色體異常疾病等研究有用的菌株。

2018 年，以中國科學院覃重軍研究組為主的研究團隊通過 15 輪的染色體融合將釀酒酵母天然的 16 條染色體逐一融合，人工創建了只含有單條線型染色體的酵母細胞（SY14）。在染色體的人工逐一融合過程中，構建了從 SY0 到 SY13 的染色體數目不斷減少的一系列中間菌株，最終構建的 SY14 菌株刪除了 15 個著絲粒、30 個端粒、19 個長的重復序列[7]（圖 1）。單條染色體在三維結構上有極大的改變，但是單染色體的酵母具有與野生型細胞相似的轉錄組和表型組。不僅如此，單染色體的酵母還保持了減數分裂的能力，雖然在產孢和孢子存活率上略有降低。這些都表明單染色體的釀酒酵母可以有正常的細胞功能。

圖1 人工創建的單染色體真核酵母

4 討論與展望

生命系統的復雜性使其難以分析和操作，對基因組的簡約化設計和工程化構建不僅有利于對生命起源、進化與代謝調控的研究，也為生物技術的應用提供了合適的表達宿主。從基因組簡約化的角度來看，對基因組生存非必需的基因的刪減可能并非人類想象的那么簡單。盡管對于大部分細菌和真菌基因組來說，有 80%—90% 的基因是生存非必需的。但是，這些生存非必需基因，如執行生存必需功能的冗余基因等，在不同程度的簡約化基因組背景下可能是生存必需的。對天然小基因組原核細胞支原體的“自下而上”的人工重構及簡約化設計與功能測試表明，即使是天然已經很緊湊的基因組，仍然可以繼續刪減一些基因，得到更簡約的基因組。但是，目前對簡約基因組的人工設計并沒有很好的策略，更多需要依賴大量的“設計—合成—測試”的工作。對于原核模式生物“自上而下”的基因組的刪減工作也是進展較慢，尤其是大腸桿菌的基因組簡約化工程已進行了近 20 年的研究，不同的課題組從不同的菌株出發進行基因組連續刪減獲得的菌株（基因組僅為約 3 Mbp），均遠遠無法接近理論上的最小基因組（約 300 個基因，大小約 0.3 Mbp）。這表明人類的理性設計簡約化基因組人造生命還處于比較初期的階段。

然而，從其他方面進行基因組的簡約化的成功嘗試，比如對釀酒酵母多條染色體的端粒和著絲粒的刪減，并將天然的 16 條染色體融合為 1 條，使得染色體間及染色體內的相互作用都大大簡約化。這提示我們，天然復雜生命系統是可以通過人工設計和改造進行簡約化并以全新的生命形式表現出來的。