巖藻低聚糖的酶法制備及活性分析

王鳳舞，闕 斐，寇玲赟，遲 方，王 瑩,*

（1.青島農業大學食品學院，山東 青島 266109；2.浙江經貿職業技術學院，浙江 杭州 310018）

巖藻聚糖硫酸酯又稱巖藻多糖、褐藻糖膠，是一種高分子質量硫酸雜多糖。經研究表明，它具有廣泛的藥理學活性，包括抗氧化、抗凝血、抗炎、抗腫瘤、免疫調節、抗菌抗病毒、降血糖血脂、促益生菌生長[1-4]等。巖藻聚糖硫酸酯在治療癌癥、糖尿病、肥胖等領域也具有良好的應用前景，目前已經成為海洋藥物研究的熱點之一[5-8]。在美國、日本、德國和挪威，該糖均已經作為治療的候選藥物進入臨床研究[9]；在俄羅斯已作為一種多功能保健食品于2006年上市[10]；在中國作為一種治療慢性腎病[8]的海洋藥物的主要成分，也已經成功開發上市[11-12]。

巖藻聚糖硫酸酯的相對分子質量從幾萬到幾十萬不等，而大分子多糖口服生物利用度較低，對其進行降解獲得低分子質量的產物是提高其生物利用度的有效手段[13-15]。研究報道，分子質量在5～50 kDa的巖藻聚糖硫酸酯具有更高的生物活性[16]，比如：對于抗氧化、抗血栓、抗炎、抗補體、抑制癌細胞等方面都比大分子多糖具有優勢[17-22]。低分子質量巖藻聚糖硫酸酯的抗氧化活性不僅與分子質量有關系，還與硫酸根的含量、取代基位置等因素有密切關系[23-26]。目前，在巖藻聚糖硫酸酯的降解方法中，酶法降解由于其專一性強、條件溫和、不損失硫酸根、重復性好等優勢，被公認為最理想的方法。

目前，有關巖藻聚糖硫酸酯酶解產物抗氧化活性的報道較少，少數的研究也都是在實驗選定的水平中進行比較尋優，沒有實現在整個范圍內進行最優化。鑒于上述方法過程高度的復雜性，實驗運用人工神經網絡與遺傳算法[27-28]聯合對酶解過程進行最優化，從而實現在指定范圍內得到最高抗氧化活性的酶解產物。為進一步驗證人工神經網絡和遺傳算法聯合對酶解條件的預測與優化是否準確，對酶解產物的抗氧化活性進行體內實驗對比驗證，為生產應用提供一定實驗支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

產酶菌MD3由山東省中韓食品生物技術研究中心前期篩選獲得；SPF級雄性小白鼠，8 周齡，由青島大任富城畜牧有限公司提供。

巖藻聚糖硫酸酯 日照潔晶海洋生物技術開發有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；VC青島農業大學校醫院；丙二醛（methane dicarboxylic aldehyde，MDA）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、抑制羥自由基能力以及蛋白質定量測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；C-buffer（20 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl溶液，含0.2 mol/L NaCl）。

種子培養基：巖藻聚糖質量分數0.2%，蛋白胨質量分數0.4%，用過膜海水配制；產酶培養基：巖藻聚糖質量分數0.2%，蛋白胨質量分數0.2%，用過膜海水配制。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；UH-1200B超聲波細胞破碎儀 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；FD-1D-80冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；DU-800型紫外-可見分光光度計 美國貝克曼公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司；1100高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；PPM-18S/T膜分離設備 三達膜（廈門）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 巖藻聚糖硫酸酯酶的制備

將活化后的菌種MD3接種于種子培養基，25 ℃、180 r/min水浴恒溫振蕩器培養12 h制備一級種子液。隨后按照體積分數10%接入250 mL三角瓶（裝50 mL產酶培養基），25 ℃、150 r/min培養48 h，獲得發酵產物。隨后將培養液在10 000 r/min冷凍離心10 min，收集菌體。每2 g濕菌體用50 mL冷凍C-buffer復溶，在冰浴保護下于500 W進行超聲破碎15 min（工作5 s，停止5 s），10 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液得到粗酶液，將其冷凍干燥成粉末備用，在使用時用蒸餾水復溶至凍干前的體積。

1.3.2 酶活力測定

酶活力的測定采用鐵氰化鉀法，具體步驟參考王瑩[30]方法。

1.3.3 基本酶解工藝條件優化

量取2 mg/mL巖藻聚糖樣液（用C-buffer溶解）4 mL，按加酶量12 U/mg加入巖藻聚糖硫酸酯酶，調節C-buffer用量，使反應體系總體積為10 mL，在25 ℃、120 r/min水浴振蕩器酶解2 h，所得酶解液于80 ℃滅酶20 min，10 000 r/min離心15 min，取上清液，備用。考察加酶量（0、6、12、18、24、30、36 U/mg）、酶解時間（0、5、10、15、20、25 h）、酶解溫度（20、25、30、35、40、45、50 ℃）3 個因素對酶解產物分子質量分布及DPPH自由基清除率的影響，確定后續試驗的優化范圍。并在此優化范圍內，參照均勻設計和正交試驗原理，設計122 組試驗，從而為BP網絡的建模提供“教師信號”，并為后續遺傳算法的優化奠定基礎。

1.3.4 分子質量分布測定

以高效凝膠排阻色譜方法檢測分子質量的變化。色譜條件如下：色譜柱：TSK-gel G4000 PWXL（30 cm×7.8 mm，10 μm）；柱溫：40 ℃；流動相：0.2 mol/L NaCl溶液；流速：0.5 mL/min；檢測器：示差檢測器。以分子質量為4.11、5、66.9、140、148 、410、670 kDa的葡聚糖系列為標準品。采用Agilent GPC軟件分析分子質量分布。

1.3.5 人工神經網絡建模

使用3 層前向神經網絡模擬酶解條件與產物抗氧化活性的關系，學習方法采用BP算法[29]。建模過程選用前饋式3 層神經網絡，輸入層有3 個神經元，分別為酶解時間、加酶量、酶解溫度。隱含層為一層，并通過試行誤差法確定神經元個數，輸出層有1 個神經元，代表酶解產物的DPPH自由基清除率。參照均勻設計和正交設計的思想，在試驗考察范圍內，設計實施122 組試驗，隨機選取其中的107 組數據作為BP網絡的訓練樣本，剩余的15 組數據作為檢驗樣本。上述建模過程利用Matlab軟件實現，輸出層采用Purelin函數作為傳遞函數，訓練函數為Traingdm，設定BP網絡訓練步數為2000，網絡性能的目標誤差為0.01。

1.3.6 遺傳算法優化

利用Matlab軟件的遺傳算法工具箱對上述BP網絡模型進行尋優。以BP網絡模型預測結果的相反數作為適應度函數返回值編寫成M文件，作為遺傳算法的調用函數，進行尋優。初始種群數目設定20，變異概率0.05，交叉概率0.75，最大傳代數為100 代，其他參數設定為軟件默認。

1.3.7 體內實驗樣品的制備

在1.3.3節基本酶解工藝條件下，選用遺傳算法尋優獲得的最優酶解條件，在此條件下對巖藻聚糖硫酸酯進行酶解。將上清液經截留分子質量為250 Da的超濾膜過濾，除去小分子鹽類。截留液用旋轉蒸發儀進行濃縮后冷凍干燥，得到巖藻低聚糖組；巖藻聚糖硫酸酯組為提前將酶于80 ℃滅酶20 min后，其余制備流程與巖藻低聚糖組相同。

1.3.8 小鼠的分組與飼養

將40 只標記好的小鼠分成5 組，分別為：空白組、模型組、陽性組、巖藻聚糖硫酸酯組和巖藻低聚糖組。將小鼠在溫度（20±2）℃進行飼養，讓小鼠自由取食3 d，以適應環境。3 d后，用200 mg/（kg·d）（以體質量計，下同）的D-半乳糖（20 mg/mL）皮下注射各組小鼠（空白組用等量生理鹽水注射），建立小鼠衰老模型。空白組和模型組小鼠灌胃0.1 mL/（10 g·d）的生理鹽水，陽性組小鼠灌胃等體積VC，劑量為200 mg/（kg·d），巖藻聚糖硫酸酯組和巖藻低聚糖組分別灌胃等體積劑量為200 mg/（kg·d）凍干樣品（用生理鹽水溶解）。每天定時灌胃1 次，皮下注射1 次，持續42 d。

1.3.9 小鼠的血漿和肝臟組織上清液的制備

在處死小鼠之前的24 h，停止喂食，保障自由飲水。取小鼠眼球血1～2 mL于預先加入10 μL 50%檸檬酸鈉的2 mL離心管內，4 000 r/min、4 ℃低溫離心5 min，取上清液，備用。脫頸處死小鼠，解剖取肝臟，-20 ℃保存。使用時用組織研磨器研磨均勻，制成10%肝臟組織勻漿，5 000 r/min、4 ℃低溫離心5 min，取上清液備用。1.3.10 抗氧化能力的測定

體外實驗抗氧化能力采用DPPH自由基清除率測定方法，參照王瑩[30]方法。體內抗氧化能力依據CAT活性、抑制羥自由基能力及MDA含量測定，參見試劑盒說明書。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 加酶量對產物分子質量分布和DPPH自由基清除率的影響

圖1 加酶量對酶解產物分子質量分布和DPPH自由基清除率的影響Fig. 1 Effects of enzyme concentration on molecular weight distribution and DPPH scavenging activity of hydrolysates

在不同加酶量條件下，會獲得不同分子質量的巖藻聚糖硫酸酯，同時，其分子質量與其生物活性存在著很大的相關性[18,20,31-32]。由圖1可知，在25 ℃酶解2 h的條件下，加酶量達到24 U/mg以上時，酶解產物的分子質量均不存在顯著差異（P＞0.05），說明酶的作用完全；且當加酶量在0～24 U/mg范圍內時，酶解產物的DPPH自由基清除率出現了顯著變化，涵蓋了最小值16.32%和最大值70.44%，這個范圍屬于酶的有效降解范圍，因此，綜合分子質量的變化結果，選擇加酶量范圍為0～24 U/mg。

2.2 酶解時間對產物分子質量分布和DPPH自由基清除率的影響

圖2 酶解時間對酶解產物分子質量分布和DPPH自由基清除率的影響Fig. 2 Effects of hydrolytic time on molecular weight distribution and DPPH scavenging activity of hydrolysates

由圖2A可知，在加酶量12 U/mg、酶解溫度25℃條件下，酶解5、10、15、20、25 h時酶解產物的分子質量分布沒有顯著性差異（P＞0.05），說明酶解5 h酶已經作用完全，且在5 h以內產物的DPPH自由基清除率就涵蓋了最高值（51.18%）和最低值（16.50%），因此應該繼續補充8 h以內的酶解實驗。由圖2B可知，酶解4 h以后產物分子質量分布沒有顯著性差異，且0～4 h內酶解產物的DPPH自由基清除率出現整個范圍內的最高值（66.13%）和最低值（16.50%），屬于酶的有效降解范圍，因此后續優化試驗范圍設定在0～4 h。

2.3 酶解溫度對產物分子質量分布和DPPH自由基清除率的影響

圖3 酶解溫度對酶解產物分子質量分布和DPPH自由基清除率的影響Fig. 3 Effects of hydrolytic temperature on molecular weight distribution and DPPH scavenging activity of hydrolysates

由圖3可知，在加酶量12 U/mg、酶解時間2 h條件下，酶解溫度達到40 ℃以上，對酶解產物分子質量沒有顯著影響（P＞0.05），在20～40 ℃內，酶解產物的DPPH自由基清除率涵蓋了最低值（30.68%）和最高值（75.40%），屬于酶的有效降解范圍，因此，綜合分子質量的變化結果，將酶解溫度設定為20～40 ℃。

綜合上述單因素試驗結果，選擇加酶量0～24 U/mg、酶解時間0～4 h、酶解溫度20～40 ℃作為人工神經網絡的模擬范圍。

2.4 BP網絡模型的建立

在優化范圍內實施122 組試驗作為BP網絡的教師信號，數據見表1，檢驗樣本數據見表2。通過Matlab軟件，利用教師信號對上述BP網絡模型對DPPH自由基清除率進行訓練。試錯法確定BP網絡模型隱含層神經元個數為20 個，BP網絡模型經過不到50 步訓練后，網絡性能達到穩定。15 個檢驗樣本的預測誤差總和為49.8，其中最大誤差小于8%（圖4），說明該BP網絡模型能夠很好地模擬酶解過程產物的DPPH自由基清除率，該模型訓練總時間僅為3.3 s，說明建模過程十分快速。

表1 BP網絡的訓練樣本Table1 Training samples for BP network

表2 BP網絡檢驗樣本Table2 Test samples for BP network

圖4 BP網絡預測與期望輸出Fig. 4 Predicted and expected output of BP network

2.5 應用GA對酶解條件進行尋優

圖5 GA的尋優進化曲線Fig. 5 Evolutionary curve of GA optimization

利用Matlab軟件GA工具箱，經過51 代進化，由圖5可知，GA尋優得到最大DPPH自由基清除率85.1%，對應的酶解條件為酶解溫度26.4 ℃、酶解時間2.3 h、加酶量20.7 U/mg。

2.6 最優結果驗證

以最優條件為基礎，在酶解溫度26 ℃、酶解時間2.3 h、加酶量20.7 U/mg的條件下進行巖藻聚糖硫酸酯的酶解，測定酶解產物的DPPH自由基清除率達到83.7%，與預測值85.1%誤差僅1.4%，說明利用人工神經網絡與遺傳算法聯合的方法對酶解過程進行尋優是可行的。并利用高效凝膠排阻色譜測定酶解產物的重均分子質量為18.2 kDa。

2.7 體內抗氧化實驗結果

表3 小鼠血漿和肝臟組織中CAT活性、MDA含量、羥自由基抑制能力Table3 CAT activity, MDA content and hydroxyl radical scavenging activity in rat serum and liver tissues

由表3可知，模型組與空白組相比，模型組小鼠的肝臟組織和血漿的CAT活性、羥自由基抑制能力有顯著性下降，MDA含量顯著升高說明模型建立成功。與模型組相比，巖藻聚糖硫酸酯組和巖藻低聚糖組小鼠的肝臟組織和血漿的CAT活性和羥自由基抑制能力都有顯著提高，MDA含量顯著降低，說明巖藻聚糖硫酸酯和巖藻低聚糖都具有抗氧化能力。且巖藻低聚糖組肝臟和血漿的CAT活性、羥自由基抑制能力顯著高于巖藻聚糖硫酸酯組，MDA含量顯著低于巖藻聚糖硫酸酯組，說明小分子的巖藻低聚糖有更好的抗氧化效果。與陽性對照組VC相比，巖藻聚糖硫酸酯組抗氧化能力較弱，巖藻低聚糖組與其相當（除血漿中抑制羥自由基能力以外）；上述結果可以說明，巖藻低聚糖組比巖藻聚糖硫酸酯組具有更顯著的抗氧化活性，進一步印證BP網絡模型與遺傳算法聯合優化效果顯著，所獲得的巖藻聚糖硫酸酯酶法降解產物抗氧化活性顯著增強。

3 討 論

本實驗運用人工神經網絡和遺傳算法，以產物抗氧化活性為指標優化酶解條件，實現了整個酶解范圍內的優化。宋亮[33]、王共明[34]、楊青丹[35]等都是通過使用單因素試驗、正交試驗等來優化酶解工藝；文獻[36-37]研究發現DPPH自由基清除率與其分子質量有關，且分子質量越小抗氧化活性越好；Millet等[38]從鉤角藻巖藻多糖中得到了低分子質量（8 kDa）的組分，發現其具有很高的抗血栓活性；Zhuang Cun等[39]從鼠尾藻中分離出多個不同分子質量的巖藻低聚糖組分，并發現巖藻低聚糖組分顯著延長了患癌小鼠的存活時間，存活率分別比對照組高了3.49 倍和2.15 倍。但上述所有的研究都是在很小的實驗范圍內進行比較尋優，沒有實現多維空間內的最優化。本實驗發現當酶解溫度、加酶量、酶解時間分別為20～40 ℃、0～24 U/mg、0～4 h時，酶解產物分子質量會發生顯著變化，以此作為優化范圍。通過107 組試驗數據作為教師信號的訓練樣本，建立了模擬巖藻聚糖硫酸酯酶解過程的BP網絡模型，并利用15 組數據對模型進行檢驗，所建模型預測值與實際輸出誤差小于8%，該模型訓練總時間僅為3.3 s，可以用于對酶解過程的模擬。利用遺傳算法對上述模型進行尋優，得到酶解產物的最大DPPH自由基清除率為85.1%，此時對應的酶解條件為酶解溫度26.4 ℃、酶解時間2.3 h、加酶量20.7 U/mg，測得上述酶解產物的重均分子質量為18.3 kDa。考慮到實際生產，在酶解溫度26 ℃、酶解時間2.3 h、加酶量20.7 U/mg時進行酶解，測得其DPPH自由基清除率為83.7%。并測得上述酶解產物的重均分子質量為18.2 kDa。體內動物實驗結果表明，巖藻低聚糖比巖藻聚糖硫酸酯在清除羥自由基、降低MDA含量及CAT活性方面具有更顯著的抗氧化作用，為工業化制備高抗氧化活性巖藻聚糖硫酸酯酶解產物提供了實驗支撐。同時，利用BP網絡并聯合GA進行尋優的模式，可以推廣到酶解產物的任意一種生物活性，只要實驗誤差在合理的范圍內，便可期待進行模擬和尋優。

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