超高效液相色譜-質譜法測定母乳中12 種低聚糖

陳新新，蘆 晶，劉 鷺，逄曉陽，張書文，李 誠*，呂加平,*

（1.中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193；2.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014）

乳寡糖是母乳中主要營養成分之一，成熟乳中低聚糖的質量濃度為7～12 g/L，初乳中的質量濃度更高，約為24 g/L[1]。低聚糖又稱寡糖，由2～10 個單糖通過糖苷鍵連接而成，構成母乳的單糖主要有葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）、巖藻糖（fucose，Fuc）、N-乙酰葡萄糖胺（N-acetylglucosamine，GlcNAc）和N-乙酰神經氨酸（N-acetylneuraminic，NeuAc）5 種，且母乳低聚糖均存在1 個由半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺組成的核心結構，其他糖單元通過不同的形式連接在周圍構成了母乳低聚糖結構的多樣性[2-3]。目前，已知的母乳低聚糖有200多種[4]。研究發現乳寡糖除了為新生兒提供營養之外還具有重要的生物學作用[5-7]，其可以選擇性地促進有益細菌如雙歧桿菌在腸道中的生長，防止病原性細菌（例如痢疾桿菌、大腸桿菌等）的黏附，調節嬰幼兒的免疫系統，從而降低新生兒患疾病的風險[8-9]；近期也有研究發現酸性低聚糖對幼兒的大腦發育起著重要作用[10]。低聚糖的生理功能與結構特征密切相關，因此了解低聚糖的結構極其重要，而研究乳寡糖的結構功能的前提是對乳寡糖進行定性定量分析[8-11]。由于母乳低聚糖結構復雜且存在多種同分異構體，這使得乳寡糖的分離具有一定的難度[12]。目前對母乳低聚糖的定量研究較少，多側重于乳寡糖的定性和相對定量，建立一種母乳低聚糖的快速測定及定量方法具有重要意義。

目前常用的低聚糖分析方法主要有核磁法、高效液相色譜法和液相色譜-質譜法等[13]。雖然核磁法在低聚糖的結果表征中起到重要作用，但由于所需樣品量大、分析較為復雜使其應用受到局限[14-15]。近年來，高效液相色譜-串聯質譜法已成功用于低聚糖的分離、鑒定和單糖組成分析[16]。

本實驗旨在建立一種母乳中12 種低聚糖的快速測定方法。通過對母乳進行脫脂除蛋白前處理后，利用優化好的超高效液相色譜條件使母乳中的12 種低聚糖得到了很好分離，并采用三重四極桿質譜對其12 種母乳低聚糖成分實現了準確定量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

母乳 北京某醫院志愿者；母乳低聚糖標準品：2-巖藻糖乳糖（2-fucosyllactose，2FL）、3-巖藻糖乳糖（3-fucosyllactose，3F）、3-唾液酸乳糖（3-sialyllactose，3SL）、6-唾液酸乳糖（6-sialyllactose，6SL）、乳酰-N-巖藻五糖Ⅰ（lacto N-fucopentaoseⅠ，LNFPⅠ）、乳酰-N-巖藻五糖Ⅲ（lacto N-fucopentaose Ⅲ，LNFPⅢ）、乳酰-N-二巖藻六糖Ⅱ（lacto-N-difuco-hexaoseⅡ，LNDFHⅡ）、乳酰-N-己糖（lacto N-neohexaose，LNnH）、二唾液乳-N-四糖（disialyllacto-N-tetraose，DSLNT）、乳糖基四糖a（lactosialyl tetrasaccharide a，LSTa）、乳糖基四糖b（lactosialyl tetrasaccharide b，LSTb）、乳糖基四糖c（lactosialyl tetrasaccharide c，LSTc） 法國ElcitylOligoTech公司；乙腈（色譜純） 美國Fisher公司；甲酸銨（色譜級） 美國Sigma公司；無水乙醇（分析純） 北京化工廠。12 種母乳低聚糖具體結構信息[17]見表1。

表1 12 種母乳低聚糖結構Table1 Structures of 12 human milk oligosaccharides

1.2 儀器與設備

ACQUITY UPLC氨基色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm） 美國Waters公司；MVS-1渦旋混合器 北京金北德工貿有限公司；3K15離心機 美國Sigma公司；ZLS-4真空旋轉蒸發儀 湖南赫西儀器裝備有限公司；ULUP-IV-10T超純水裝置 西安優普儀器設備有限公司；ME55精密電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JD-3電子天平 沈陽龍騰電子有限公司；MF50雪花制冰機 北京長流科學儀器公司；1290系列超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜儀美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

取所購12 種母乳低聚糖標準品各1 mg，溶解于1 mL的超純水中，渦旋混勻后，得到質量濃度1mg/mL的標準品儲備液，存放-80 ℃備用。由于12 種母乳低聚糖在母乳樣品中含量差別較大，通過閱讀文獻，將12 種母乳低聚糖標準品分為兩部分做標準曲線[18-19]。

取2FL、3FL各10 μL，加入80 μL超純水，此時2 種標準品的混標質量濃度為100 mg/L，取此混合標樣逐級稀釋；取3SL、6SL、LNFPⅠ、LNFPⅢ、LNDFHⅡ、DSLNT、LNnH、LSTa、LSTb、和LSTc各5 μL，加入50 μL的超純水混勻，此時該10 種標準品的混標質量濃度為50 mg/L，取此混合樣逐級稀釋成不同的質量濃度，如表2所示。

表2 12 種標準品溶液的質量濃度Table2 Concentrations of 12 standard oligosaccharide solutions

1.3.2 母乳低聚糖的提取

獲得母乳低聚糖的關鍵在于除蛋白，目前最常用的脫除蛋白方法有乙醇沉淀法和乙腈沉淀法[20-21]。2 種實驗方法具體如下：

取母乳樣品5 mL，6 000 r/min、4 ℃離心10 min后，去除上層脂肪，然后將乳液裝入特定規格的超高速離心管，（1×105）×g、4 ℃超高速離心90 min，離心后，乳樣分為兩部分，乳寡糖位于上清液中，底部沉淀為酪蛋白，獲取上清液，加入2 倍體積的無水乙醇，4 ℃放置4 h，10 000 r/min、4 ℃離心10 min后取上清液，此操作重復2 次后真空濃縮至干，然后加入超純水稀釋過膜后用于檢測[22]。

取母乳樣品500 μL，加入等體積的超純水，6 000 r/min、4 ℃離心10 min后，去除上層脂肪，取下層清液加入1.5 mL的乙腈，渦旋混勻后超聲5 min，在10 000 r/min、4 ℃離心10 min后取上清液，此操作重復2 次，稀釋后即可用來上樣。

1.3.3 高效相色譜條件

ACQUITY UPLC氨基色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫50 ℃；流速0.3 mL/min；流動相A為10 mmol/L的甲酸銨溶液，流動相B為乙腈；獲得最優流動相條件：0～10 min，95%～75% B；10～15 min，75% B；15～20 min，75%～65% B；20～21 min，65%～10% B；21～24min，10% B；24～25 min，10%～95% B；25～35min，95% B。

1.3.4 質譜條件

電噴霧離子源；正離子掃描；干燥氣體溫度150 ℃，干燥氣體流速16 L/min；霧化器壓力35 psi；毛細管電壓3 kV；保溫氣體溫度300 ℃；保溫氣體流速12 L/min。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的選擇

圖1 不同前處理方法母乳低聚糖總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of human milk oligosaccharides with different pretreatment methods

用2 種不同的前處理方式處理后的母乳樣品，按照優化好的超高效液相色譜-質譜條件進樣測定，檢測結果如圖1所示。由于乙醇沉淀法采用旋干后加超純水復溶，去除了乙醇的溶劑效應，故對比2 種前處理方法后母乳低聚糖總離子流圖的響應值即可確定最優前處理方法。圖1a用乙腈前處理的母乳低聚糖的響應值為4.4×106，明顯高于圖1b用乙醇處理后的母乳樣品低聚糖的響應值，約為2.2×106，通過后臺對比峰面積可知用乙醇沉淀蛋白時低聚糖的損失量較大（低聚糖通過峰面積來定量），因此，本實驗采用乙腈沉淀法作為母乳蛋白質的脫除方法。

2.2 質譜條件的確定

2.2.1 全離子掃描結果

Scan type 選擇MS2scan，分別對12 種母乳標準品進行母離子全掃描，如表3所示，在正離子模式下12 種低聚糖均出現加鈉母離子峰[23-24]。

2.2.2 子離子掃描結果

在Scan Type選擇Product Ion，對12 種母乳低聚糖標準品的加鈉母離子做子離子掃描，以獲得12種低聚糖的離子對，掃描結果見表4。由于糖本身并不容易裂解，12 種低聚糖均找到一個響應較好的子離子。

表4 12 種母乳低聚糖標準品子離子掃描結果Table4 Results of product ion scanning of 12 breast milk oligosaccharides

2.2.3 MRM優化結果

表5 12 種母乳低聚糖標準品多反應監測優化結果Table5 Results of MRM optimization for 12 oligosaccharides in breast milk

對已經找到的12 種母乳低聚糖標準品的離子對進行碰撞能量的優化，優化結果見表5。2FL、3FL、3SL、6SL、LNFPⅠ、LNFPⅢ、LNDFHⅡ、DSLNT、LNnH、LSTa、LSTb、LSTc 12種母乳低聚糖標準品多反應監測最優碰撞能量分別為40、38、35、34、58、67、46、34、67、43、40、34 V。

2.3 超高效液相色譜條件的確定

將12 種母乳低聚糖標準品配成5 mg/L混標用于液相條件優化實驗。根據Amide氨基柱的特點（有機相不低于50%），初步設定流動相條件為：A為10 mmol/L甲酸銨，B為乙腈，流速為0.3 mL/min。采用梯度洗脫，0～40 min，95%～65% B，12 種母乳低聚糖混標的總離子流圖見圖2a。根據之前優化牛乳低聚糖獲得的分離經驗[13]，在圖2a的基礎上進行液相條件的不斷優化，實驗結果證明改變進樣時間對低聚糖的分離影響不大，故從流動相的配比上進行優化，通過改變梯度和走等度，獲得最優梯度條件：0～10 min，95%～75% B；10～15 min，75% B；15～20 min，75%～65% B；20～21 min，65%～10% B；21～24 min，10% B；24～25 min，10～95% B；25～40 min，95% B，最優梯度條件下12 種母乳低聚糖混標的總離子流圖見圖2b。

圖2 母乳低聚糖在不同流動相條件下的總離子流圖Fig. 2 Total ion current chromatograms of human milk oligosaccharides under different mobile phase conditions

由圖2可以看出，圖2a中12 種母乳低聚糖并沒有得到分離，而圖2b中12 種低聚糖則得到了很好分離，且從后臺提取12 種低聚糖的質譜多反應監測圖譜，同分異構體均得到分離，該梯度條件下，可用于12 種母乳低聚糖的測定分析。

2.4 回歸方程及精密度結果

將稀釋好的不同質量濃度的母乳低聚糖標準品按優化好的條件進樣分析，樣品的質量濃度設為自變量X（mg/mL），色譜峰的峰面積Y設定為因變量，獲得12 種低聚糖標準對照品標準曲線回歸方程、線性相關系數以及其線性范圍。按所述超高效液相色譜檢測條件連續重復進樣檢測（n＝3），根據物質的色譜峰峰面積相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）來評價儀器的精密度，如表6所示。12 種母乳低聚糖標準品在設定的質量濃度范圍內呈良好的線性關系（R2＞0.98）。超高效液相色譜分析檢測方法精密度良好，12 種糖類成分重復進樣分析的RSD均控制在10%以內。

表6 12 種母乳低聚糖標準品回歸方程Table6 Regression equations for 12 breast oligosaccharide

2.5 加標回收率實驗結果

表7 12 種母乳低聚糖標準品回收率檢測結果Table7 Recovery of 12 breast milk oligosaccharides from spiked samples

做加標回收實驗評估方法的準確度。取母乳200 μL進行前處理后，并按照優化好的檢測條件對其中的12 種低聚糖成分進行定量分析，獲得不加標樣品分析結果。然后取同一母乳樣200 μL（每份樣品重復3 次），根據測得的各低聚糖成分實際含量水平加標[25-26]，并進行樣品檢測，12 種母乳低聚糖的加標回收結果見表7。不同添加量條件下，12 種母乳低聚糖的添加回收率均在80%～120%之間，樣品前處理方法的準確性用RSD表示，且實驗所得12 種低聚糖的RSD值均小于10%。因此，本實驗所建立的方法可以用母乳中12 種低聚糖的檢測分析[27]。

2.6 母乳低聚糖的測定結果

圖3 母乳低聚糖總離子流圖Fig. 3 Total ion current chromatogram of oligosaccharides in real breast milk sample

表8 成熟母乳中低聚糖測定結果Table8 Results of determination of oligosaccharides in mature human milk

對志愿者提供的成熟母乳進行前處理后按照建立的測定方法進行12 種低聚糖成分的測定，為減少實驗誤差，同1 份母乳樣品測定3 次求平均值。母乳低聚糖的總離子流圖見圖3，測定結果見表8。通過閱讀大量文獻對12 種母乳低聚糖的質量濃度范圍進行了總結，從母乳低聚糖的實驗測定結果來看，12 種低聚糖的RSD均小于10%，且測定結果均在參考文獻范圍之內。12 種母乳低聚糖中2FL的質量濃度最高，與魏京華等[21]的結果一致。

3 結 論

本實驗所建立的12 種母乳低聚糖的測定方法，前處理過程簡單且所需樣品量少，12 種低聚糖標準品在設定質量濃度范圍內均線性良好（R2＞0.98），添加回收率均在80%～120%之間，實驗重復性和儀器精密度較好。

綜上所述，本實驗方法簡單可行，可在短時間內對母乳中的12 種低聚糖進行準確的定性定量分析。

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