植物源食品中α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的測定及比較分析

崔亞娟，孔凡華，劉國杰*，魯 緋，李 東

（1.中國農業大學園藝學院，北京 100094；2.北京市營養源研究所，北京市系統營養工程技術研究中心，北京 100069）

類胡蘿卜素是一類重要的天然色素的總稱，普遍存在于動物、高等植物、真菌、藻類中的黃色、橙紅色或紅色的色素之中，性質極其不穩定，受熱、遇氧、見光容易受到破壞。迄今，被發現的天然類胡蘿卜素已達600多種[1-2]，其中幾種常見的類胡蘿卜素有α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質、番茄紅素及蝦青素等。常見類胡蘿卜素如表1所示。研究表明，類胡蘿卜素物質主要存在于天然果蔬中[3-4]，具有較強抗氧化性[5]、可以預防和治療糖尿病[6]、減少心血管疾病發病率[7]、保護視力和抗癌[8]等多種生理功能。在自然條件下類胡蘿卜素是動物體內VA的主要來源，約有10%的類胡蘿卜素（主要為α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素）是VA的前體，其中β-胡蘿卜素的VA原活性最高[9-10]，這主要是因為β-胡蘿卜素具有的對稱結構，1 分子β-胡蘿卜素可以產生2 分子的VA[9]。隨著人們健康意識的增強，對天然類胡蘿素的需求大大增加，開發利用類胡蘿卜素已經成為一個引人注目的發展趨勢[11-12]。

表1 常見幾種類胡蘿卜素的分子式和結構式Table1 Molecular formulas and structures of several carotenes

植物源食品中類胡蘿卜素的測定方法以及背景資料是開展類胡蘿卜素營養研究工作的重要基礎[13]。目前，食物中類胡蘿卜素的測定方法有分光光度法[14]、柱層析法[5,15]、薄層色譜法[16]、高效液相色譜法[17-18]、質譜[19]、電化學檢測器[20]、核磁共振[21]。分光光度法適用于測定單一類胡蘿卜素的量，不能對多種類胡蘿卜素分別定量；薄層色譜法和柱層析法成本低廉，能對多種胡蘿卜素進行分離，但分析時間長、重復性差且不能精確定量；質譜、核磁共振和電化學檢測器等串聯儀器設備昂貴，測定成本高。高效液相色譜法具有分離效能高、分析速度快等優點，目前基本采用反相高效液相色譜法，并配合紫外-可見光檢測器或二極管陣列檢測器，對樣品中的類胡蘿卜素進行定性定量分析。研究人員用液相色譜法測定油料作物種子[22]、小麥類[23]、番茄和胡蘿卜[24]、白菜[25]、茶[26]、水果[27]等多種植物源食品中類胡蘿卜素的含量，但不同植物源食品中類胡蘿卜素含量及其活性比較研究較少，目前我國尚缺少植物源食品中各種類胡蘿卜素組分含量方面的背景資料和相關數據[28]，因此，建立、完善測定植物源食品中各種類胡蘿卜素組分的方法亟待解決，建立一個同時測定胡蘿卜素的定量方法，對于正確評價各種水果蔬菜及植物源食品的營養價值，開展營養學的研究至關重要。本實驗在借鑒前人研究的基礎上，利用高效液相色譜法建立植物源食品中α-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素的同時在線分析檢測，以胡蘿卜凍干粉為樣品進行方法學驗證，并用該方法測定多種植物源食品中胡蘿卜素的含量并進行比較分析，旨在為科研和實際應用提供理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胡蘿卜凍干粉 實驗室自制；果蔬、谷物、植物油、茶等樣品各6 種 市購；β-胡蘿卜素標準品（純度＞95.0%）、α-胡蘿卜素標準品（純度＞95.0%） 美國Sigma公司；甲醇、乙腈、三乙胺、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、正己烷（均為色譜純） 美國Fisher公司；無水硫酸鈉、乙醇、氫氧化鉀、丙酮、三氯甲烷、石油醚、抗壞血酸（均為分析純） 北京化工廠。

1.2 儀器與設備

BS224S分析天平 德國賽多利斯公司；EYELA N-1100旋轉蒸發儀 東京理化株式會社；98-Ⅱ-B磁力攪拌電熱套 天津市泰斯特儀器有限公司；L-2000高效液相色譜儀 日本日立科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

稱取胡蘿卜凍干粉約0.03 g和果蔬、谷物、植物油、茶等樣品2～5 g（精確至0.000 1 g），置于250 mL平底燒瓶中，加入10 mL抗壞血酸水溶液（10%），再加入30 mL乙醇溶解，搖勻，加入質量分數50%氫氧化鉀溶液10 mL，混勻，于磁力攪拌電熱套上皂化回流30 min，取出立即放入冷水中冷卻。

將皂化后的液體轉移至500 mL分液漏斗中，用約50 mL水分2 次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用50 mL石油醚分2 次洗皂化瓶，石油醚液同樣轉移至分液漏斗，將分液漏斗置于振蕩器上振搖，280 r/min振搖2 次，每次振搖3 min，其間放氣；振搖后取下分液漏斗，靜置分層，將下層溶液轉移至另一分液漏斗中，重復上述步驟2 次；棄去下層液體，合并2 次提取液后用水洗至中性；將液體經過約5 g無水硫酸鈉后濾入150 mL蒸發瓶中，用約10 mL石油醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉3 次，并入蒸發瓶中。將蒸發瓶接至旋轉蒸發儀上蒸發，蒸至近干后用氮氣吹干蒸發瓶，取下蒸發瓶，剩余物用甲醇-乙腈-二氯甲烷-正己烷（3∶4∶4∶4，V/V）溶液定容至5 mL，樣品過0.45 μm濾膜，備用。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：YMC C30（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為乙腈-甲醇-三乙胺溶液（70∶30∶0.05，V/V），流動相B為甲基叔丁基醚-三乙胺溶液（100∶0.05，V/V）；檢測波長450 nm；柱溫30 ℃；進樣體積20 μL；洗脫程序：0～27 min，100%～45% A，0%～55% B；27.0～27.1 min，45%～100% A，55%～0% B，保留8 min。

1.3.3 胡蘿卜素含量的測定

胡蘿卜素含量按下式計算：

式中：X為樣品中胡蘿卜素含量/（μg/100 g）；c為由標準曲線而得的試樣溶液中胡蘿卜素質量濃度/（μg/mL）；V為試樣溶液最終定容體積/mL；m為試樣質量/g。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

2.1.1 α-胡蘿卜素標準曲線的繪制

α-胡蘿卜素標準儲備液：稱取α-胡蘿卜素標準品1 mg（精確到0.1 mg），用丙酮定容至10 mL棕色容量瓶中，臨用前在波長450 nm處用丙酮作空白于分光光度計上標定溶液濃度。

α-胡蘿卜素標準工作液：從α-胡蘿卜素標準儲備液中分別準確移取1、1、1、2、1 mL溶液轉移至100、50、25、25、5 mL棕色容量瓶中，用丙酮定容至刻度，得到質量濃度為0.8～20 μg/mL的標準系列工作液，分別進樣20 μL。按1.3.2節色譜條件測定，記錄所得峰面積，以峰面積為橫坐標，以標準溶液質量濃度為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程為y=1.886 3×10-6x，R2=0.999 7。

2.1.2 β-胡蘿卜素標準曲線的繪制

β-胡蘿卜素標準儲備液：準確稱取β-胡蘿卜素標準品10 mg（精確到0.1 mg），用三氯甲烷定容至10 mL棕色容量瓶中，臨用前在波長450 nm處用正己烷作空白于分光光度計上標定溶液濃度。

β-胡蘿卜素標準中間液（20 μg/mL）：從β-胡蘿卜素標準母液中準確移取1.0 mL溶液轉入50 mL棕色容量瓶中，用甲醇-乙腈-二氯甲烷-正己烷（3∶4∶4∶4，V/V）溶液定容至刻度，得到質量濃度為20 μg/mL的標準中間液。

β-胡蘿卜素標準工作液：從β-胡蘿卜素標準中間液中分別準確移取1.0、2.0、2.0、1.0、2.0 mL溶液轉入50、50、25、5、5 mL棕色容量瓶中，用甲醇-乙腈-二氯甲烷-正己烷（3∶4∶4∶4，V/V）溶液定容至刻度，得到質量濃度為0.4～8.2 μg/mL的系列標準工作液，分別進樣20 μL。按1.3.2節色譜條件測定，記錄所得峰面積，以峰面積為橫坐標，以標準溶液質量濃度為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程為y=9.183 7×10-7x，R2=0.999 2。

2.2 方法精密度的測定結果

準確稱取0.03 g（精確至0.000 1 g）胡蘿卜凍干粉樣品，做6 個平行，進行α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素含量測定。如表2所示，胡蘿卜凍干粉中α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的平均值分別為25.8 mg/100 g和16.1 mg/100 g，標準偏差分別為1.15 mg/100 g和0.76 mg/100 g，相對標準偏差分別為4.45%和4.71%。實驗具有較好重復性，能夠滿足對樣品測定平行的要求。

表2 胡蘿卜凍干粉中胡蘿卜素的含量Table2 Carotene content of freeze-dried carrot powder

2.3 加標回收率的測定結果

表3 胡蘿卜素加標回收實驗結果Table3 Recoveries from spiked samples

取胡蘿卜凍干粉為樣品基質，分別以樣品本底的0.5、1、2 倍添加低、中、高3 個添加量的標準溶液，每個質量濃度水平重復3 次測定，分別計算加標回收率和相對標準偏差。如表3所示，α-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素加標回收率分別為96%～112%、83.5%～103%，加標回收率的相對標準偏差分別為2.67%～5.83%、4.90%～7.42%，能夠滿足檢測實際樣品需要。胡蘿卜凍干粉中α-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素的譜圖如圖1所示。

圖1 胡蘿卜凍干粉中α-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素譜圖Fig. 1 HPLC-UV chromatograms of α-carotene and β-carotene in freezedried carrot powder

2.4 植物源食品中胡蘿卜素含量的測定結果

2.4.1 水果中胡蘿卜素含量的測定結果

選取杏、西瓜、柿子、獼猴桃、蘋果和櫻桃6 種常見水果，用優化方法同時測定α-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素的含量，如表4所示，杏中的胡蘿卜素含量最高，總量達到3 000 μg/100 g以上，西瓜次之，櫻桃中的胡蘿卜素含量最低，低于30 μg/100 g。

表4 6 種水果中胡蘿卜素的含量Table4 Carotene contents of six fruits

2.4.2 蔬菜中胡蘿卜素含量的測定結果

表5 6 種蔬菜中胡蘿卜素的含量Table5 Carotene contents of six vegetables

選取辣椒、南瓜、番茄、西葫蘆、紅薯和油菜6 種常見蔬菜，用優化方法同時測定α-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素的含量，如表5所示，辣椒中胡蘿卜素含量最高，總量達到3 000 μg/100 g以上，南瓜次之，油菜中的胡蘿卜素含量最低，低于20 μg/100 g。

2.4.3 谷物中胡蘿卜素含量的測定結果

表6 6 種谷物中胡蘿卜素的含量Table6 Carotene contents of six cereals

選取大米、小米、藜麥、玉米面、黃豆和黑豆6 種常見谷物，用優化方法同時測定α-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素的含量，如表6所示，谷物中胡蘿卜素含量整體較低，總量均低于60 μg/100 g，可見，果蔬是胡蘿卜素的主要食物來源，谷物可以輔助提供胡蘿卜素的供給[29-30]。

2.4.4 植物油中胡蘿卜素含量的測定結果

表7 6 種植物油中胡蘿卜素的含量Table7 Carotene contents of six vegetable oils

選取紅棕櫚油、沙棘籽油、植物油、菜籽油、橄欖油和亞麻籽油6 種植物油，用優化方法同時測定α-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素的含量，如表7所示，紅棕櫚油中胡蘿卜素含量最高，總量近5 000 μg/100 g，亞麻籽油中胡蘿卜素含量最低，含量為160 μg/100 g，可見植物油中胡蘿卜素含量比較高。

2.4.5 茶中胡蘿卜素含量的測定結果

表8 6 種茶中胡蘿卜素的含量Table8 Carotene contents of six types of tea

選取辣木茶、黑茶、巖茶、古樹茶、桑葉茶和茶菊6 種茶類，用上述方法同時測定α-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素的含量，如表8所示，茶中胡蘿卜素含量非常高，辣木茶和黑茶胡蘿卜素總量均在10 000 μg/100 g以上，其他茶中胡蘿卜素含量也在2 800 μg/100 g以上，只有茶菊中胡蘿卜素含量較低，為888 μg/100 g。

3 結論與討論

本實驗利用高效液相色譜法建立了植物源食品中α-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素的同時在線分析檢測，并以胡蘿卜凍干粉為樣品進行了方法學驗證，該方法線性良好，穩定性好，回收率滿足分析要求。與目前常用方法相比，優化了樣品前處理過程，縮短了分析時間。

姚建花等[31]報道，選用胡蘿卜、玉米、蜜橘、菠菜制備混樣，用直接溶劑提取法和皂化提取法進行比較，結果顯示，α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素均為皂化提取效果更好，樣品經皂化后，葉綠素已破壞，皂化可排除葉綠素干擾，皂化提取法適用于所有果蔬類樣品。張彩凌等[32]同時采用直接提取法和皂化提取法對β-胡蘿卜素進行測定，并對2 種方法的結果進行了比較，結果表明皂化不會影響β-胡蘿卜素含量測定，因此，本研究選用皂化提取法。

本實驗用該方法測定了不同的水果、蔬菜、谷物、植物油、茶葉等植物源食品中α-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素的含量，不同的植物源食品中二者含量差異較大，茶葉和植物油中胡蘿卜素含量普遍較高、果蔬中胡蘿卜素含量次之、谷物中胡蘿卜素含量較低，盡管谷物不是胡蘿卜素的主要提供者，但即使是低含量的谷物食物用該實驗所建的方法也能檢測到，可見該方法靈敏度高，能夠為企業研發、質量控制和相關科學研究提供較為合適的方法保障，同時會給相關機構和部門提供準確的檢測方法和完備的技術支持。

本實驗篩選了30 種常見植物源食品進行研究，為后期營養膳食數據庫的建立提供數據基礎。絕大多數植物源食物中α-胡蘿卜素的含量小于β-胡蘿卜素，與文獻報道一致，只有南瓜中α-胡蘿卜素的含量高于β-胡蘿卜素。

本實驗數據可以為科研和實際應用提供一定的理論數據和技術支持，但還不能完全反映出我國大量植物源食品中胡蘿卜素的含量及差異，日后還會繼續增大樣品量的研究，同時該數據可以為食物成分數據庫的完善提供數據支持。

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