Th17細胞及IL—17表達水平在脊柱結核患者病情發展中的意義分析

卓祥龍

摘要目的：探討脊柱結核外周血中Th17細胞的數量變化及IL-17表達，尋求治療新靶點。方法：收治脊柱結核患者30例，選擇健康者30例，均檢測外周血單核細胞中Th17細胞比例和血漿中IL-17含量。結果：脊柱結核組治療前Th17細胞數量高于健康組（P<0.05），結核組術后12個月的Th細胞數量和IL-17量較術前明顯降低（P<0.05）。結論：Th17細胞和IL-17因子是介導脊柱結核病情發展的重要免疫因素，Th17細胞和IL-17可能是脊柱結核患者在細胞免疫治療方面的一個新靶點。

關鍵詞Th17細胞；IL-17表達水平；脊柱結核

脊柱結核是常見的脊柱感染性疾病，隨病情進展可出現嚴重的脊柱和周圍軟組織破壞，甚至導致神經系統損傷，對患者的健康和生活產生嚴重的影響。目前，雖有學者對脊柱結核損傷的發病機制進行了大量研究，但尚沒有確切的定論，多數學者認為可能與結核桿菌大量復制所造成的直接損傷和免疫介導等因素有關。Th17細胞是新發現的CD4輔助T細胞亞群，參與多種炎癥感染及自身免疫疾病的組織損傷。研究表明，肺結核患者的胸水及外周血中可檢測到IL-17 mRNA表達，且外周血IL-17的表達比正常對照組顯著增高，組織細胞中有IL-17蛋白表達，組織中存在Th17細胞，提示Th17細胞亞群及其效應分子IL-17參與了結核的病理過程。本項目目的是初步探討脊柱結核外周血中Th17細胞的數量變化及IL-17表達情況的分析，并尋求脊柱結核的治療新靶點。

資料與方法

樣本采集及處理：分別于術前及術后1周、1個月、6個月、12個月采集30例脊柱結核患者（年齡30～71歲）外周血標本，并按上述時間點采集30例健康者的外周血作為對照，每例抽取30 mL外周血，在血液標本中加入人淋巴細胞分層液后離心處理（室溫，2 000 rpm，30 min），分離出外周血單核細胞及血漿，血漿于低溫保存，待ELISA法檢測IL-17。本研究經柳州市工人醫院倫理委員會審批同意。

主要試劑及儀器：人細胞因子IL-17酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購于上海酶聯生物科技公司，PE-抗人CD4單克隆抗體、FITC-抗人IL-17單克隆抗體購于上海谷研科技有限公司，流式細胞儀為BD FACSCalibur flowcytomeler，軟件為FCS ExpressV3。

流式細胞術檢測外周血單核細胞中Thl7細胞比例：取外周血制成懸液，調整細胞密度至1×10/mL，接種于24孔板，加入PMA（50 ng/mL；Mdrich，St.Louis，MO）、離子霉素（1μg/mL）和莫能新（2μmol/mL），置于恒溫箱（37℃，5%C02）培養6 h。加人PE-抗人CD4單克隆抗體10 μL，避光室溫染色30min，以4%多聚甲醛固定，破膜劑破膜后加FITC-抗人IL-17單克隆抗體10μL，室溫染色30 min，洗滌后重懸細胞，用流式細胞儀檢測。

IL-17水平測量：取上述血漿用ELISA法測量IL-17含量，具體按照ELISA試劑盒（R&D Systems，Minneapolis，MN）說明書的方法進行，所有標本均雙份測量，讀取酶標儀450 nm處0D值。

統計學方法：采用SPSS 13.0分析，計量資料采用（x±s）表示，t檢驗，計數資料使用率（%）表示，x2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結果

一般資料比較：所有受試者均為漢族，30例脊柱結核患者中，男16例，女14例，年齡19～68歲，平均45.5歲；健康對照組中，男15例，女15例，年齡18～66歲，平均46.2歲。脊柱結核患者組與健康對照組在人種、年齡、性別方面相比差異無統計學意義（P>0.05）。

外周血單核細胞中Thl7細胞比例：流式細胞儀檢測外周血單核細胞中CD4及IL-17均陽性的細胞為Th17細胞的比例。比較脊柱結核及健康者各個時期的Th17細胞比例：脊柱結核患者術前及術后1周、1個月、6個月、12個月的Th細胞比例分別為（9.2±0.9）%、（9.0±0.8）%、（4.2±0.3）%、（3.6±0.3）%、（2.1±0.2）%，健康者術前及1周、1個月、6個月、12個月的Th細胞比例分別為（1.8±0.2）%、（2.2±0.2）%、（2.4±0.3）%、（2.1±0.2）%、（1.9±0.1）%，脊柱結核組治療前的Thl7細胞數量明顯高于健康組（P<0.05），但結核組術后12個月的Th細胞數量較術前明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），見圖1。

血漿IL-17水平：ELISA法測量結果顯示：脊柱結核患者術前及術后1周、1個月、6個月、12個月的IL-17水平為（70.25±6.35）ng/L、（68.15±7.50）ng/L、（53.28±6.55）ng/L、（32.45±5.52）ng/L、（31.75±4.65）ng/L，健康者術前及1周、1個月、6個月、12個月的IL-17分別為（34.36±4.38）ng/L、（41.15±4.55）ng/L、（43.56±5.85）ng/L、（40.12±6.45）ng/L、（38.66±6.15）ng/L，脊柱結核組治療前的IL-17量明顯高于健康組（P<0.05），結核組術后12個月的IL-17量較術前明顯降低（P<0.05），見圖2。

討論

針對不同病原體的免疫應答免疫細胞會起不同的特化作用，CD4+T細胞可產生不同細胞因子，發揮特異性免疫應答作用，其中INF-7可活化巨噬細胞，殺滅留在巨噬細胞中的病原體。Th17細胞是CD4+T細胞中的一個亞群，因其分泌的IL-17細胞因子而得名。本研究檢測脊柱結核外周血中Th17細胞比例，結果表明結核患者較健康者血液中Th17細胞顯著增高，且手術治療去除脊柱相關病灶后，外周血中Th細胞的含量會一定程度下降；同時通過ELISA法檢測表明，脊柱結核患者血漿中IL-17水平也較健康者顯著增高，表明Th17細胞及IL-17參與了脊柱結核的免疫應答，并在脊柱結核病灶的形成及病情發展中發揮了一定的作用。

研究表明，Th17細胞分泌的IL-17通過對中性粒細胞的趨化來殺滅細胞外的病原體。然而，結核桿菌是一種浸潤細胞內的病原體，這種胞內菌IL-17的作用機制仍然不明，最近的研究表明IL-17能夠增強患者對一些胞內病原體的免疫力，但遠不如對胞外菌感染的抗菌效果明顯，如感染亞致死量沙門氏菌的IL-17缺失鼠，其脾和肝中病菌量增加。本研究通過ELISA法檢測發現，健康患者外周血中檢測不到IL-17蛋白的高表達，但脊柱結核患者體內檢測到大量的IL-17蛋白，且手術后時間越長的患者中外周血IL-17水平越較入院初期明顯降低，提示脊柱結核患者外周血中可能存在記憶性的產生IL-17的細胞，這些細胞在感染結核后分泌IL-17。同時，血漿IL-17水平與Th17細胞在患者術前及術后數量變化趨勢一致，提示血漿IL-17的表達增加與Th17細胞的比例增高相關。

本研究發現Th17細胞比例和IL-17水平在脊柱結核病灶清除術后都較入院初期降低，提示脊柱結核病灶的擴大可能與Th17細胞和IL-17介導的免疫應答有關。脊柱結核病灶被巨噬細胞吞噬，這種胞內結核菌的存在和增殖引發的宿主免疫反應是影響脊柱結核病灶擴大和轉歸的決定性因素。結核較為有特征性的病理改變為結核性肉芽腫，如干酪壞死組織中含有大量結核菌，可長期休眠。IL-17能通過中性粒細胞遷移到病灶周圍來抗感染，從而發揮免疫保護作用，但過多的中性粒細胞也會引起脊柱結核病灶的擴大及形成冷膿腫。研究表明，在活動性結核患者體內中性粒細胞是最主要的受感染細胞類型，這些細胞也是結核桿菌長期潛伏的場所，在適宜的條件下能再度繁殖，造成病灶擴大或病情反復。

綜上所述，Th17細胞和IL-17在脊柱結核患者體內的含量遠高于健康者，且經手術治療后，Th17細胞和IL-17含量在一定時期內會有所下降，表明Th17細胞和IL-17是介導脊柱結核病情發展及病灶擴大的重要免疫因素，因此，Th17細胞和IL-17是脊柱結核患者在細胞免疫治療方面的一個新靶點。如何控制Th17細胞和IL-17在免疫保護及免疫破壞方面的平衡將為脊柱結核的防治方法提供新思路。endprint