依賴解旋酶的等溫擴增技術在手足口病檢測中的應用研究

王曉，唐美媛

（廣西壯族自治區桂林醫學院附屬醫院檢驗科，廣西 桂林 541001）

0 引言

手足口病具有病情進展速度快、發病范圍廣以及負面影響大等諸多特點，并且近年來其上升趨勢較為明顯[1]，其中腸道病毒71型與柯薩奇病毒A16型在手足口病的暴發流行發揮了重要作用[2-3]，發病后因感染部位不一，嚴重程度也不相同，若病情控制不及時，會出現危及患兒生命的嚴重后果[4]。本研究對收治手足口病兒童EV71、CA16及HFMD其他EV病原各40例標本分別進行依賴解旋酶恒溫擴增技術檢測。

1 資料與方法

1.1 標本來源和數量

本次研究選取2014年6月至2015年12月醫院收治的手足口病兒童（EV71、CA16及HFMD其他EV病原各40例）標本。按照《手足口病預防控制指南》進行檢驗標本的收集、儲存以及轉運等操作。排除臨床資料不符合《實用兒科學》中診斷標準、不配合以及臨床資料欠缺的患兒，患兒年齡最小的9個月左右，年齡最大的10.1歲。

1.2 標本采集和保存

根據不同檢驗標本選擇所采集的時間。發病72h內針對患兒采集血液、皰疹液以及咽拭子標本。采集后的標本放-70℃冰箱保存。

1.3 儀器及方法

BSC-1500生物安全柜、K30干式恒溫儀、2720PCR儀、HYDRASY2電泳儀。試劑是美國NEB公司RT-tHDA反應試劑盒。引物探針根據HDA技術要求從GenBank數據庫EV、EV71和CA16序列。普通RT-PCR引物序列參照《手足口病防控指南》。通過建立RT-tHDA法進行檢測，普通擴增產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測判斷結果。HDA擴增反應根據兩步法以及一步法的效果，確定合適的反應程序。

1.4 技術方法評價

參照方法：普通RT-tHDA以普通RT-PCR方法作為參照進行評價。評價指標：特異性核酸擴增產物的酶切鑒定以及序列測定；利用EV71、CA16、其他型EV做陽性、諾如病毒、輪狀病毒做陰性，檢測確定其特異性。檢測系列稀釋的已知拷貝數的RNA以確定靈敏度，檢測所有臨床標本確定其符合率。

1.5 統計學方法

將所有標本的基本資料、研究數據均采用SPSS17.0軟件進行分析。正態計量數據用“Mean±SD”表示，非正態數據采用Median（IQR），兩組獨立、正態、方差齊資料組間比較采用t檢驗；非正態分布的采用非參數秩和檢驗；多組獨立，正態，方差齊資料組間比較采用單方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-tHDA的特異性

用RT-tHDA對EV71、CA16、HFMD其他EV、諾如病毒、輪狀病毒樣本進行檢測，結果顯示，用腸道病毒通用反應液檢測EV、EV71、CA16均出現特異性擴增產物，具有典型的特異條帶呈陽性，諾如病毒、輪狀病毒及陰性標本沒有特異性擴增產物呈陰性，用EV71反應液檢測，EV71均出現特異性擴增產物，具有典型的特異條帶呈陽性，CA16、諾如病毒、輪狀病毒及陰性標本沒有特異性擴增產物呈陰性，用CA16反應液檢測，CA16均出現特異性擴增產物，具有典型的特異條帶呈陽性，EV71、諾如病毒、輪狀病毒及陰性標本沒有特異性擴增產物呈陰性，檢測結果具有較強的特異性。

2.2 RT-tHDA的靈敏度和符合率

將已知RNA原液稀釋后檢測其濃度，各標本的最低濃度為500copy/tude，具有較高靈敏度。臨床標本通過RT-tHDA方法檢測結果與RT-PCR法檢測結果對比，陽性結果的符合率為91.28%～100.00%，平均為95.24%，陰性檢測結果符合率為100.00%。

3 討論

病毒感染性疾病目前是我國公共衛生領域具有挑戰性的重要健康問題。臨床早期診斷是手足口病治療的第一道防線，手足口病主要是由EV71病毒或CA16病毒等多種病毒引起的，主要發生于學齡兒童，臨床可通過早期診斷、早期治療以及隔離等手段進行有效治療[5-7]。RT-tHDA的作用機制為通過利用在早期診斷腸道病毒感染具有突出優勢，RT-tHDA技術是模擬動物體內DNA的合成方式，是一種可在75～90min完成真正恒溫下進行檢測的一種技術，具有簡便、高效的特點，與其他基因擴增技術相比，可在基層醫院對手足口病進行快速檢測提供早期診斷依據[8-10]。HDA作為新型的等溫擴增技術，其中通過使DNA解旋酶解開DNA雙鏈，其受解旋酶的解旋速度、結合以及延伸長度所需要，臨床實際操作中模板靶序列超過400bp會使擴增效率明顯降低，優質的DNA解旋酶決定了擴增效果。本次研究中通過建立RT-tHDA方法，證實了RT-tHDA檢測法具有靈敏度高、特異性強的特點。

綜上所述，通過建立RT-tHDA方法可在2h內完成檢測工作，作為臨床針對手足口病的快速檢測方法可有效提供第一道防護屏障，經濟適用性高以及對設備要求低，在基層醫院較為適用，值得臨床推廣并廣泛應用。

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