GeneXpert MTB/RIF技術對肺結核的診斷效能評估

趙 平，余 琴，張 喻，陳 亮

(1.首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院醫學檢驗科/尿液細胞分子診斷北京市重點實驗室 100038；2.北京市朝陽區疾病預防控制中心結核病門診部 100029)

目前，結核病仍然是世界范圍內致死率較高的傳染病。2015年，全世界大約有1 040萬人新發結核病，140萬人死于結核病[1]。我國是全球結核病高負擔國家之一，結核病患者數居世界第二位，并且占全球病例數的11%，2015年的發病人數估計在91.8萬人[1-2]。缺乏準確、快速的結核分枝桿菌檢測方法是結核病治療管理方面的主要障礙。目前我國結核病防治所和一些綜合醫院主要依靠痰涂片檢查抗酸菌和羅氏固體培養并結合患者臨床癥狀和X線表現來診斷肺結核。結核分枝桿菌培養被認為是最終診斷的“金標準”，但是培養耗時較長，一般2～8周出結果。盡管痰涂片萋-尼氏染色顯微鏡檢查抗酸菌是一種快速并且廉價的檢測方法，但是其敏感性較差[3]。因此，依賴于核酸擴增技術的結核分枝桿菌快速檢測對患者的早期治療，改善患者預后以及進行有效的公共衛生干預都非常重要[4]。近幾年，多種分子生物學方法已經被用于結核病的診斷和結核分枝桿菌耐藥的快速檢測，包括線性探針試驗、實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)和GeneXpert MTB/RIF技術等。但是，在我國分子生物學技術檢測痰標本中結核分枝桿菌還不是一線檢測方法，其檢測效能還需進一步確定。本研究對GeneXpert MTB/RIF技術在診斷肺結核方面的能力進行評估，探討其在基層實驗室的應用前景。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年1-6月來北京市朝陽區結核病門診就診的疑似肺結核患者治療前的痰標本240份，每份標本3～5 mL，其中112份來自女性患者，128份來自男性患者，患者年齡16～78歲，中位年齡為36.5歲，疑似肺結核患者的診斷按照《肺結核診斷標準(WS288-2008)》執行。

1.2儀器與試劑 光學顯微鏡(Olympus，CX31RBSF)、萋-尼(Ziehl-Neelsen，Z-N)染色液(珠海貝索生物技術有限公司，BASO)、BACTEC MGIT 960 結核分枝桿菌快速培養系統(M960,Becton Dickinson and Company，Sparks，Maryland，USA)、GeneXpert檢測系統和檢測試劑盒(Cepheid,Inc,Sunnyvale,CA,USA)。

1.3方法

1.3.1涂片、染色及鏡檢 每份痰標本先進行涂片，并對涂片進行萋-尼染色，光學顯微鏡下檢查抗酸桿菌。涂片、染色及鏡檢方法按《現代結核病診斷技術》[5]方法操作。

1.3.2培養及藥敏試驗 涂片后的每份痰標本被分為兩份，一份用L-半胱氨酸氫氧化鈉法進行去污染處理[6]。處理后的標本接種在M960液體培養基中，放在M960系統內進行培養，培養方法參照儀器說明書進行。培養陽性的菌株用M960系統進行異煙肼、利福平、鏈霉素和乙胺丁醇的敏感性試驗，方法參照試劑盒說明書。于此同時，陽性菌株接種在對硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養基上進行初步的菌種鑒定。

1.3.3GeneXpert MTB/RIF試驗 另一份標本按照文獻[7-8]及產品說明書進行GeneXpert MTB/RIF試驗。即用2.0 mL 的GeneXpert MTB/RIF樣本處理液加入到含1 mL痰標本的無菌離心管中，室溫靜置15 min，期間手動震蕩離心管2次，取處理后的標本2.0 mL 加入到測試盒中，將測試盒放入到儀器內進行檢測。

1.3.4質量控制 在每批次痰標本進行涂片染色鏡檢時，以卡介苗菌液涂片為陽性質控，以大腸埃希菌菌液涂片為陰性質控，陰性和陽性質控片各1張。每批次結核分枝桿菌培養和藥敏試驗均使用標準敏感菌株H37Rv進行質控檢測。 GeneXpert MTB/RIF法每個測試進行樣品處理質量控制(SPC)和探針檢查質量控制(PCC)，同時對H37Rv菌株進行檢測。

1.4統計學處理 采用SPSS16.0軟件對數據進行統計分析，應用χ2檢驗對涂片、培養和GeneXpert MTB/RIF系統的檢驗效能進行比較分析，一致性檢驗采用Kappa檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1質控結果 每批次卡介苗菌液涂片抗酸染色均陽性，大腸桿菌菌液涂片抗酸桿菌染色均陰性；H37Rv質控菌株培養均陽性，異煙肼、利福平、乙胺丁醇和鏈霉素的藥敏試驗均敏感；GeneXpert MTB/RIF試驗在檢測標本時有1份標本出現質控無效，造成檢測結果失敗，每批次檢測H37Rv時DNA檢測均陽性，利福平藥敏試驗結果均為敏感。

2.23種方法陽性檢出情況 痰涂片鏡檢陽性率為18.8%(45/240)，M960培養陽性率為33.8%(81/240)，GeneXpert MTB/RIF陽性率為36.3%(87/240)。GeneXpert MTB/RIF和M960培養與痰涂片鏡檢陽性率之間的差異均有統計學意義(χ2=18.49、13.99，P<0.05)，GeneXpert MTB/RIF與M960培養陽性率之間的差異無統計學意義(χ2=0.33，P>0.05)。以M960培養為金標準，GeneXpert MTB/RIF的靈敏度為84.0% (68/81，95%CI：76.0～91.9)，特異度為87.8(129/147，95%CI：82.5～93.1)，陽性預測值(PPV)為78.2%(68/87，95%CI：69.5～86.8)，陰性預測值(NPV)為87.2% (129/148，95%CI：81.8～92.6)；涂片鏡檢的靈敏度為51.9%(42/81，95%CI：41.0～62.7)，特異度為98.6(145/147，95%CI：96.8～100.0)，PPV為93.3%(42/45，95%CI：86.0～100.0)，NPV為75.1% (145/193，95%CI：69.0～81.2)。GeneXpert MTB/RIF和涂片鏡檢在靈敏度、特異度、PPV和NPV之間差異均有統計學意義(χ2=19.15、13.73、4.92、7.68，P<0.05)。

2.33種方法陽性檢出時間比較 GeneXpert MTB/RIF系統陽性結果報告時間(從標本處理到陽性結果報出)為2.5 h；痰涂片顯微鏡檢查報陽時間平均為3.5 h(包括涂片、干燥、染色及鏡檢時間)；M960培養系統陽性報告時間平均為12 d，培養42 d無結核分枝桿菌生長報告培養陰性。

2.4藥敏試驗結果比較 GeneXpert MTB/RIF檢出7例利福平耐藥，耐藥率2.9%(7/240)，M960系統比例法藥敏試驗檢出4例利福平耐藥，6例異煙肼耐藥，8例鏈霉素耐藥，8例乙胺丁醇耐藥，利福平耐藥率1.7%(4/240)，兩者比較差異無統計學意義(χ2=0.84,P>0.05)。GeneXpert MTB/RIF檢測出7例利福平耐藥，其中4例M960系統藥敏試驗顯示為利福平耐藥，并且是耐多藥，2例M960系統培養陰性，1例M960系統藥敏試驗顯示為利福平敏感。

2.5GeneXpert MTB/RIF和M960系統一致性分析 兩種方法檢測結核分枝桿菌的一致性為82.8%，Kappa值為0.73(95%CI：0.61～0.86)。

2.6GeneXpert MTB/RIF和M960系統不一致分析 所有標本中有19份標本GeneXpert MTB/RIF系統檢測陽性，但M960系統培養陰性，通過查閱患者病歷，這19例患者中有15例被醫生診斷為肺結核，并進行了相應的治療，治療后病情好轉。有4例被診斷為肺結核陳舊灶或穩定灶，未進行抗結核治療。

3 討 論

GeneXpert MTB/RIF系統是一種自動、快速的分子診斷設備，集標本處理和半巢式PCR于一體的結核分枝桿菌鑒定和利福平耐藥檢測設備，其操作簡單、方便[8]。在HIV高流行或結核病高耐藥地區此技術已經作為疑似肺結核的一線檢測方法。

GeneXpert MTB/RIF試驗以半巢式PCR為基礎，此技術將PCR的樣品準備、DNA擴增和DNA檢測3個步驟整合在一起。樣品處理后加入到測試盒中，在微流樣品盒里完成DNA提取的所有復雜步驟，并可將提取的DNA進行濃縮和純化，以增加測試的靈敏度。濃縮純化后的標本DNA進入微反應管中，并在其中擴增至被檢測到。DNA提取、檢測的整個過程均在儀器配套的密閉的測試盒內完成，完全實現自動化，避免人為因素的污染。其對DNA序列的檢測具有高度光學敏感性，實時的熒光監測使得軟件一經發現目標序列即可及時給出結果，極大縮短了檢測時間，檢測全過程僅2 h。

本研究對 GeneXpert MTB/RIF在臨床痰標本中檢測結核分枝桿菌的檢測效能進行了初步評估。以前的研究顯示，以M960培養為標準，GeneXpert MTB/RIF系統檢測結核分枝桿菌的靈敏度為86.2%～97.1%，特異度為95.3%～99.4%[9-11]。在本研究中，GeneXpert MTB/RIF系統檢測結核分枝桿菌的陽性率為36.6%，明顯高于涂片檢查(18.49%)，差異有統計學意義(P<0.05)，略高于M960液體培養系統陽性率(34.0%)，差異無統計學意義(P>0.05)。其靈敏度和特異度分別為84.0%和87.8%，與以往的研究結果相似。

涂片鏡檢的陽性率明顯低于GeneXpert MTB/RIF方法和培養，主要是因為其方法的局限性，每毫升標本中需要1 104～5 103個菌才能檢出[12]，GeneXpert MTB/RIF方法每毫升痰標本需要131個標本就能檢出[7]，而將痰標本離心濃縮后培養其陽性檢出限可達到10～100 CFU/mL[12]。

本研究中，與M960培養系統比較，GeneXpert MTB/RIF系統顯示出了較好的陽性檢出率，與M960系統具有較好的一致性，并且陽性檢出時間明顯短于培養方法，這對早期發現患者，快速診斷、及時治療患者非常重要。

本研究中有19份標本GeneXpert MTB/RIF檢測陽性，但M960培養陰性，13份標本GeneXpert MTB/RIF檢測陰性，但M960培養陽性。這可能主要是因為標本中的菌量在檢測方法檢出限水平附近時，在檢測過程中受到外界的影響較大，如標本采集、標本的處理等都可能影響到檢測結果的準確性。另外，GeneXpert方法是檢測結核分枝桿菌DNA，包括活菌和死菌的DNA。而M960培養只能檢測到活菌，因此，在標本處理過程中被殺滅掉的結核分枝桿菌不能被M960系統檢測到，而GeneXpert系統可能檢測出。一些標本被M960系統檢測出結核分枝桿菌，而GeneXpert系統未檢測出，可能是由于標本中菌量未達到GeneXpert系統的檢出限。

結核分枝桿菌中的rpo B基因是利福平耐藥基因，95%以上對利福平耐藥的結核分枝桿菌有rpo B基因的變異。GeneXpert MTB/RIF技術檢測結核分枝桿菌對利福平的耐藥性是以rpo B基因為靶基因。儀器自動提取結核分枝桿菌DNA后，對rpo B基因的192 bp片段進行檢測，并采用6種分子信標同時檢測6種探針，其中5個相互重疊分子探針(分別以探針A-E命名)選擇性覆蓋rpo 基因的81 bp核心區，檢測結核分枝桿菌存在的同時可以探知利福平是否耐藥。 本研究顯示，7例對利福平耐藥，其中4例M960顯示利福平耐藥，2例M960培養陰性，1例顯示敏感。有文獻報道，以常規藥敏試驗為檢測利福平耐藥的金標準，GeneXpert MTB/RIF技術對利福平耐藥的靈敏度和特異度分別為94.1%和97.0%[13-14]。另外，有大約86%的利福平耐藥菌株同時對異煙肼耐藥，因此，在利福平耐藥的情況下，一定程度下可作為耐多藥結核分枝桿菌的監測指標[15]。 由于本研究中耐利福平病例數較少，因此其藥敏結果與M960藥敏結果的比較還需進一步研究。

綜上所述，GeneXpert MTB/RIF系統技術操作簡便，陽性檢出率和敏感性均較高，并且不需較高的專業技能，普通技術人員經過基本的培訓即可操作。因此，該方法在我國基層實驗室對結核病診斷及利福平耐藥患者的篩查有一定的應用前景。

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