臍帶間充質干細胞治療戰傷的關鍵技術研究

郭德鑌，蔡學敏，阮光萍，朱向情，何 潔，趙 晶，王 強，王金祥，龐榮清，潘興華

由于高性能大規模殺傷武器的威力更加強大，可能在短時間內導致大批傷情復雜、傷勢嚴重的復合傷傷員，戰傷治療的困難超乎尋常，傳統救治觀念正在受到挑戰。臍帶間充質干細胞（UCMSC）具有自我更新、快速生長、多向分化、免疫調節等生物學特點，用于戰傷治療可挽救生命和減少殘缺。

1 現代戰傷的特點

戰傷是人體遭受物理、化學、生物、精神等致傷因素作用后引起的人體結構的完整性與功能破壞，包括創傷、失能、中毒、精神障礙等[1]。戰傷特點：（1）武器殺傷威力大、機制復雜、作用時間長、傷情不易判斷、救護難度大；（2）一種武器有幾種殺傷機制，造成沖擊傷、燒傷、機械傷、輻射傷等多種傷情復合出現；（3）高技術武器傷涉及從分子、細胞、組織、器官到整體的損害，常傷及相鄰器官、遠隔器官，甚至造成全身遲發性反應，檢查、治療困難；（4）可能出現以往戰傷中沒有見過的微波、次聲、激光、超聲損傷，新武器、新致傷機制、新傷情；（5）高新武器的使用可導致不見創傷，但內臟器官已嚴重損害的傷情，傷情隱蔽，常規檢查難以識別；（6）易發生應激障礙，心理創傷救治需求突出。

2 UCMSC治療戰傷的原理

戰傷實際上是對細胞結構與功能的損害，常繼發缺血、感染、炎癥等，引起組織細胞變性、壞死、缺失，從而導致組織缺損和器官功能障礙。UCMSC治療機制是維護細胞的穩態、修復受損的細胞，再生或補充缺失的組織細胞。UCMSC具有自動向損傷組織游走、遷移和歸巢的特性，即便通過靜脈輸入體內，它也可以自己去尋找損傷組織，并遷移、定植于損傷組織中發揮治療作用[2]。UCMSC向損傷組織歸巢，就象炎癥反應后大量白細胞遷移到炎癥組織一樣，能夠在損傷組織釋放的趨化因子、粘附分子、生長因子、炎癥因子、整合素和酶等多種因素的協同作用下，通過趨化因子與UCMSC表面受體結合而驅動并跨越血管內皮細胞，遷移至損傷組織。UCMSC的歸巢是一個多步驟、多因子參與的復雜過程，涉及趨化因子的吸引、生長因子（HGF）的調節、整合素的協同、炎癥因子的促進、血管內皮細胞生長因子的輔助等。UCMSC特異性歸巢決定于損傷組織釋放因子的吸引作用，而其表面表達的相應受體決定其是否接受歸巢信號的指揮。損傷組織釋放的因子與UCMSC表面的相應配體結合后，可驅動UCMSC歸巢程序，沿著毛細血管內皮細胞壁滾動，然后通過表達粘附分子、生長因子及整合素家族成員等特異性分子黏附于毛細血管，再通過內皮進入靶組織[3]。

UCMSC可被誘導分化成脂肪、骨、肌肉、神經、胰島等細胞，具備替代戰創傷中損傷細胞和重建組織器官的潛能。在體外誘導UCMSC定向分化，主要是通過在培養體系中添加特定的細胞因子、小分子化合物，或改變培養條件等。在體內，UCMSC的分化具有組織特異性，其分化方向決定于組織微環境的作用。在戰傷條件下，歸巢到損傷組織的UCMSC可在組織微環境誘導下，定向分化為相應的組織細胞，直接整合于組織中參與損傷修復。在放射傷、系統性炎癥、創傷、退變等治療中發現，不論是通過靜脈輸入、血管介入、腔隙注射還是定位移植的MSC均顯示有治療作用，可見有部分UCMSC遷移、歸巢至損傷組織中，可在組織微環境的誘導下分化為相應組織類型的功能細胞并整合于組織之中，參與損傷組織的結構重建[4]。

UCMSC可分泌20多種涉及細胞生長、分化的細胞因子，包括轉化生長因子（TGF）、血管內皮生長因子（VEGF）、胰島素樣生長因子（IGF）、骨形成蛋白（GMP）、生長分化因子 15、IL-6、結締組織生長因子（CTGF）、肝細胞生長因子（HGF）、血小板生長因子（PDGF）、干細胞生長因子（SCF）等[5]。 體內研究證實，UCMSC通過旁分泌或遠程分泌機制促進損傷組織的原位細胞生長。UCMSC分泌SCF、VEGF、NGF的功能比其他MSC更強，促進細胞生長的作用更強大。UCMSC通過直接參與和分泌細胞因子兩種機制起協同促進損傷修復。

UCMSC在合適的條件下可分化為血管內皮細胞，形成血管樣結構。輸入體內的UCMSC可分泌VEGF、TGF-β、HGF 等，這些細胞因子可以有效促進血管內皮細胞生長和微血管再生。體內實驗也證實，UCMSC可促進肝腎纖維化、缺血損傷、股骨頭壞死組織的微血管再生，改善損傷組織的血液循環和促進缺血性損傷組織的修復。

UCMSC可通過與免疫細胞直接接觸和分泌免疫調控因子發揮免疫與炎癥調節作用[6]。在體外，UCMSC與外周血單個核細胞接觸或非接觸培養，均明顯抑制T、B淋巴細胞增殖和IFN-γ、IL-2等細胞因子的釋放，抑制抗原提呈細胞（DC）的成熟和NK細胞的活性，促進CD4+、CD25+T細胞增殖。在免疫與炎癥調節作用中，參與因素有：一氧化氮(NO)、前列腺素 E2(PGE2)、IL-10，TGF-β1、HGF、吲哚胺 2,3-doxygenase(IDO)、甲狀旁腺激素(PTH)、BMP 和 IFN-γ等。PGE2是UCMSC發揮免疫調節作用的重要介導因子，而炎癥細胞因子IFN-γ、IL-1等能顯著上調UCMSC分泌PGE2。UCMSC對免疫功能有雙向調節作用，即高劑量抑制血淋巴細胞增殖，低劑量刺激淋巴細胞增殖，在強烈的炎癥反應時抑制免疫細胞增殖、炎性細胞浸潤、炎癥介質合成與釋放，在低炎癥反應促進免疫功能。

UCMSC 釋放的外泌體（exosomes，Exo）也具有傳遞細胞間信號、清理細胞內“垃圾”以及參與免疫調節的作用[7]。人UCMSC外泌體（hucMSC-exo）可明顯抑制CD4+T和CD8+T細胞增殖，誘導CD4+、CD25+FoxP3+Treg細胞比率升高，抑制PBMC產生炎癥相關因子，如IFNγ、IL-6、TNF-α，并且具有劑量依賴性。hucMSC-exosome的典型特征是促進損傷修復，在蛋白質、mRNA、miRNA、lncRNA等水平，將特定的內容物傳遞至靶細胞中，激活或抑制某些信號通路或信號蛋白，通過調節細胞增殖、凋亡、血管再生以及免疫等多種途徑發揮組織修復功能。hucMSC-exosome可以降低血管再灌注損傷，促進腎小管上皮細胞增殖和抑制其凋亡，促進神經及血管再生，加快傷口愈合，促進細胞增殖且抑制細胞凋亡。

在UCMSC治療實驗中發現，將獼猴的UCMSC以3×106細胞/kg的劑量輸入肺纖維化的老年獼猴體內，1次/w，連續輸入3次，3個月后檢測發現，肺纖維化程度減輕，腦血流灌注增加，腎小球濾過率提高，同時還可見到外周血中的超氧化物歧化酶（SOD）、端粒酶含量升高。在UCMSC對卵巢衰老小鼠的干預實驗中發現，UCMSC可降低衰老相關基因表達水平，提高細胞自噬能力。說明UCMSC可通過提高抗氧化應激能力、促進細胞自吞噬和調節基因表達來促進損傷修復。

3 UCMSC在戰傷治療中的作用

UCMSC具有防治戰傷后組織細胞變性、壞死和進行組織損傷的修復、替代等作用。

組織器官功能維護與再生[8]：UCMSC治療具有減輕繼發性損傷、促進損傷再生修復、挽救生命和減低致殘率的作用。MSC促進各種組織損傷的修復作用已經在局部或全身性損傷疾病模型治療研究中得以證實，主要結果有：（1）對機械性、缺血性、中毒性、放射性組織損傷，甚至是一些組織損傷不明確的器官功能障礙性疾病均顯示療效；（2）不同類型的組織損傷，在接受UCMSC治療后,均發現有一定數量的UCMSC分布及分化，說明UCMSC參與了損傷修復；（3）UCMSC治療損傷的療效起決于微環境條件對急性損傷的療效更顯著；（4）對自身免疫、炎癥等導致的組織損傷治療獲得了肯定療效。

防控炎癥反應[9]：武器傷導致的燒創傷、缺血及再灌注損傷等易引發傷員過度釋放炎癥介質，導致系統性炎癥反應綜合征（SIRS），誘發發多器官功能不全（MODS）。SIRS是機體受到嚴重傷害引起的炎癥反應失控和自我破壞，是導致戰傷之后組織器官損傷和非現場死亡的重要原因。SIRS救治關鍵是控制血液循環中的炎癥啟動因子、炎癥介質及細胞裂解產物的濃度，阻斷炎癥反應的惡性循環。UCMSC治療SIR可防止或阻斷SIR過程中的細胞因子瀑布效應和炎癥介質釋放，防止傷情發展。UCMSC具有強大的抗炎和調節免疫功能的作用，不論是給創傷性還是感染性、中毒性急慢性炎癥反應的患者輸入UCMSC，均可見到炎癥反應癥狀減輕或消失，組織內炎性細胞減少，同時還可抑制組織細胞的凋亡。

組織工程：UCMSC可用于培育具有三維結構的生物組織或器官，并用于組織缺損的修復治療。目前，包含活性細胞的人工骨、皮膚、血管、角膜等已被研制成功，并在動物模型治療實驗中取得成功。在戰傷治療中，可通過計算機設計，按照需要修復組織的特定尺寸和形狀，將UCMSC、生物材料、生長因子等多元材料的混合物通過3D打印的辦法，快速、精準制造出符合戰傷治療要求的生物組織，甚至是復雜的組織或器官。將骨髓MCS與可降解生物材料復合培養后移植于骨缺損組織，MSC可增殖分化為骨細胞，形成骨組織。將MSC與特定的粘合劑、生長因子復合，用3D噴墨打印技術將復合材料噴涂在血管支架的內外層上并移植于靈長動物體內取得成功。將VEGF基因轉染MSC后與真皮支架材料一起植入全層皮膚缺損的模型，發現可促進人工皮膚的血管化及創面愈合。人工構建包含附屬血管、汗腺、皮脂腺等的人工皮膚已獲得成功。將生長因子基因導入MSC，可促進皮膚、血管細胞生長和損傷修復。

高新武器傷治療[10]：高新武器傷涉及基因層面的斷裂、突變，大分子功能蛋白的破壞，細胞和組織器官的結構破壞等，常造成組織細胞可逆或不可逆損害，常規藥物治療作用甚微。UCMSC用于高新武器傷治療具有多重生物效應，可通過直接參與、分泌多種因子和提升抗氧化應激能力等，從基因到整體不同層次發揮治療作用。在基因水平，UCMSC具有促進DNA修復的功能，能夠快速、高效地識別輻射引起的DNA損傷，通過啟動同源重組、非同源性末端接合等途徑進行DNA雙鏈斷裂的迅速修復。在發射性肺損傷治療中，UCMSC通過分化成肺泡上皮細胞和內皮細胞及細胞因子表達減輕肺水腫，修復損傷的肺組織，提高生存率，而且較低劑量就能遷移歸巢至損傷部位發揮作用。在細胞水平，將MSC移植于放射線照射的靈長類動物體內，MSC可分布于全身個組織，促進創傷局部成纖維細胞、內皮細胞、膠原纖維、毛細血管增加。UCMSC治療持續感染和壞死時，可通過分化和旁分泌作用調節局部微環境平衡，促進創面組織的血管內皮、表皮和成纖維細胞增殖及放射傷創面愈合。在視網膜色素變性、視網膜光損傷、糖尿病視網膜病變等動物模型中，MSC可通過分泌神經營養因子，抑制視網膜炎癥反應和病理損害，減輕或延緩視網膜組織損傷。MSC可通過抑制炎癥反應節、向肝細胞樣分化、抗細胞凋亡、抗氧化應激、促進血管再生等機制治療微波、貧鈾彈等導致的急性肝功能衰竭。

4 展望

UCMSC是所有干細胞中“成藥”性能最強的干細胞之一，是一種戰傷修復的理想“細胞藥品”，對促進戰傷中受損傷組織的修復、防控SIRS和構建用于戰傷修復的人工組織器官具有特別重要的軍事醫學價值，特別是對高新技術武器傷治療具有多種生物效應，滿足多層次復合損傷的治療需求，其他細胞和傳統藥物難以替代。UCMSC在戰傷救治中的優勢是材料來源充足，無倫理限制和免疫排斥問題，可以大規模、標準化生產，對戰傷治療具有通用性。本課題組建立了人UCMSC大規模體外制備技術體系，通過對神經、骨、心、肝、肺、腎、胰等局部損傷和放射傷、老年退變、SLE、SIRS等全身性損傷動物模型的UCMSC治療研究，結果顯示異體或異種UCMSC治療無明顯免疫排斥反應，對不同類型的損傷的不同階段均顯示有一定治療作用，提示UCMSC對各種戰傷，在早、中、后期均可發揮治療作用。UCMSC的作用機制涉及UCMSC定向歸巢、分化、分泌生長因子、調節炎癥與免疫、促進血管再生和提高抗氧化應激能力等。前期研究解決了UCMSC治療損傷性疾病臨床前關鍵技術問題，進一步的研究任務是建立臨床研究技術及規范，通過臨床研究驗證UCMSC的療效與安全性，使其成為戰傷治療的產品和技術。

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