耳蝸干細胞移植聯合中藥干預對感音性耳聾治療效果的影響

周 衛，何慶文（武漢市第六醫院耳鼻咽喉頭頸外科，武漢 430015）

據相關統計數據顯示，我國絕大部分聽力語言殘疾者均為感音性耳聾[1-3]。感音性耳聾常見的病因多為耳蝸與耳蝸后等部位出現病變，如噪聲性聾、藥物中毒性聾、老年性聾、先天性感音性耳聾等[4-6]。由于人類毛細胞的再生能力相對較弱，再加上毛細胞的損傷不可逆，故感音性耳聾在臨床上的治療一直比較棘手。近年來，有學者研究報道稱用中藥加以干預對感音性耳聾治療能有效解決上述問題[7-8]。本文旨在探討耳蝸干細胞移植聯合中藥干預對感音性耳聾治療效果的影響，為臨床上感音性耳聾患者的治療提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設計 隨機選取正常健康成年并且耳廓反射靈敏的豚鼠120只，雌雄兼有，清潔級，體質量（221±32）g。其中20只含藥血清制備，100只用于造模；另外選20只剛出生豚鼠（P0）用于耳蝸干細胞的培養，體質量為（6.1±0.6）g。將感音性耳聾豚鼠分成空白對照組，耳蝸干細胞移植組和干細胞移植+中藥干預組，實驗設計為隨機對照動物實驗。

1.2 主要試劑及儀器 美國Sigma公司生產的胰蛋白酶、MyosinⅦA抗體、Nestin抗體、BrdU抗體，美國Gibco公司生產的堿性成纖維生長因子、B27、胎牛血清。金壇市恒豐儀器廠生產的恒溫水浴箱；美國Healfare公司生產的二氧化碳培養箱；吳江市凈化設備總廠生產的凈化等級100級超凈工作臺；德國Leica公司生產的熒光顯微鏡、倒置顯微鏡以及丹麥生產的聽覺腦干電位儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及建模 取清醒狀態下的雙耳聽閾正常的豚鼠放于籠內，并將其固定于消聲室自由聲場中。其中豚鼠雙耳距離脈沖噪聲聲源（間隔時間為20 s，脈寬為0.25 ms，壓力峰值為180.0 dB SPL）15 cm，暴露次數為300次。在完成噪聲暴露后1周，對上述豚鼠進行ABR相關測試，并將20、16、8、4 kHz各頻率，豚鼠雙耳ABR閾值不小于60 dB SPL的豚鼠選為此次研究的備選動物。隨機將感音性耳聾豚鼠分成空白對照組（n = 30），耳蝸干細胞移植組（n = 30）和干細胞移植+中藥干預組（n =30）。

1.3.2 干細胞培養 取20只出生不久的豚鼠，使用2 mL 10%的水合氯醛進行腹腔注射麻醉后將內耳耳蝸取出，并將相關血管及表面結締組織去除，將Corti器進行分離，反復用HBSS液進行多次沖洗，然后剪成碎片，在37 ℃下用胰蛋白酶將上述碎片進行消化，25 min后用銅網（200目）進行過濾，將濾液置于離心機上進行離心4 min，轉速設置為1000 r/min，并用吸管對離心后的濾液進行輕柔吹打，裝入培養瓶，置于體積分數為5%、環境溫度為37 ℃的CO2細胞培養箱中，半量培養基每隔3 d進行一次置換，每隔7 d左右進行一次傳代，免疫熒光鑒定以BrdU和Nestin進行。

1.3.3 歸芪地黃湯含藥血清 歸芪地黃湯中包括當歸、黃芪、澤瀉、茯苓、山藥、牡丹皮、山茱萸、熟地黃8味藥，根據相關成方常用劑量（2:4:3:3:3:4:4:8）進行配伍而成。在1～6 d早晚各以劑量為20 mL/kg灌胃方式給實驗豚鼠給藥，經眼眶采血在第7天一次給藥全天劑量后1 h進行。并將所采集的血液置于4 ℃環境下靜置1 h，然后置于離心機上進行離心20 min，轉速設置為1 000 r/min，將上述分離后的血清置于56 ℃進行滅活30 min后過濾分裝，濾膜為微孔濾膜，保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.4 耳蝸干細胞移植 干細胞移植在造模后3個月進行，將豚鼠麻醉后切開左耳后分層，鉆取耳蝸底周鼓階外側壁下方一個0.2 mm的小孔，經小孔注入細胞濃度為4.0×108/L的 細胞懸液10 μL；對照組注入生理鹽水作為空白對照；干細胞移植+中藥干預組則注入細胞濃度為3.5×108/L含藥血清的細胞懸液10 μL（體積分數為10%）。完成注入后，對鉆孔進行封堵，將切口逐層進行縫合，術后并予抗生素預防感染。

1.3.5 聽閾測試 在完成耳蝸干細胞移植后7 d，28 d，56 d，10%的水合氯醛進行腹腔注射麻醉后固定豚鼠，

在其顱頂放置記錄電極，左耳乳突放置參考電極，右耳乳突放置接地電極，使用交替短聲（0.10 ms）對豚鼠進行刺激。對相關ⅴ波波形及閾值進行觀察記錄。1.3.6 免疫熒光染色 以Nestin免疫熒光染色鑒定培養干細胞成功后，使用BrdU對細胞核進行標記移植，用MyosinⅦA免疫熒光染色檢測在完成標記移植后7 d、28 d、56 d分化的毛細胞，使用熒光顯微鏡進行鏡下觀測，并對鏡下視野均值進行計數。

1.4 統計學分析 采用SPSS 22.0統計學軟件對本次數據進行統計學的分析，采用均數±標準差（）表示計量資料，并采用方差分析的方法對組間計量資料的數據進行分析。P＜0.05為組間差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 感音性耳聾模型 經過連續噪聲刺激后實驗豚鼠出現不同程度的聽力下降、體質量下降以及煩躁，在完成噪聲暴露后1周，對上述豚鼠進行ABR相關測試發現均不小于80 dB SPL，顯微鏡鏡下可見內耳毛細胞部分出現死亡、萎縮和倒伏見圖1（插頁二）。

2.2 耳蝸干細胞的鑒定及培養 在熒光顯微鏡下可見原代豚鼠耳蝸干細胞在培養皿中生長狀況良好，單細胞外觀呈類圓形，培養至4 d后有成團趨勢，見圖2（插頁二）；干細胞經Nestin熒光染色檢測顯示為陽性，此細胞增殖良好，經BrdU標記細胞核后確定所培養皿中生長的細胞為干細胞。

2.4 免疫熒光檢測結果及ABR閾值測定 耳蝸干細胞移植組和干細胞移植+中藥干預組在進行干預后均可觀測到MyosinⅦA陽性細胞及Nestin 陽性細胞，與耳蝸干細胞移植組比較，干細胞移植+中藥干預組的MyosinⅦA陽性細胞及Nestin 陽性細胞數量顯著升高，經比較2組之間差異具有統計學意義（P＜0.05）；在進行干預后，耳蝸干細胞移植組和干細胞移植+中藥干預組ABR 檢測數值均出現下調，與耳蝸干細胞移植組比較，干細胞移植+中藥干預組豚鼠的聽力顯著改善。

3 討論

感音性耳聾會對患者的學習、人際之間的交往、生活、工作產生不同程度的影響。若2歲前小兒發生感音性耳聾，聾啞癥的發生率將會大大提高[9-11]。歸芪地黃湯是由當歸、黃芪、澤瀉、茯苓、山藥、牡丹皮、山茱萸、熟地黃8味藥根據相關成方常用劑量進行配伍而成[12-13]。有學者研究報道稱用中藥加以干預對感音性耳聾治療能有效解決上述問題[14]。

研究結果顯示，在免疫熒光檢測結果方面，耳蝸干細胞移植組和干細胞移植+中藥干預組在進行干預后均可觀測到MyosinⅦA陽性細胞及Nestin 陽性細胞；2組豚鼠鼓階內Nestin陽性細胞球數量均隨著時間的延長而出現逐漸的下降，但與耳蝸干細胞移植組比較，干細胞移植+中藥干預組的MyosinⅦA陽性細胞及Nestin 陽性細胞數量顯著升高，經比較差異具有統計學意義（P＜0.05），提示歸芪地黃湯干預感音性耳聾可以明顯提高耳蝸干細胞的存活率，效果較為明顯；通過對豚鼠ABR 閾值進行檢測本研究還發現，在完成耳蝸干細胞移植后28 d 耳蝸干細胞移植組和干細胞移植+中藥干預組的聽力恢復迅速，速度到達峰值，ABR閾值下降速度也相應達到最大。在完成干細胞移植后的56 d 對2組豚鼠ABR閾值進一步進行檢測發現聽力均有相應進一步的好轉，但幅度較緩。與耳蝸干細胞移植組比較，干細胞移植+中藥干預組豚鼠的聽力顯著改善。在完成耳蝸干細胞移植后7 d對3組豚鼠ABR閾值進行檢測發現，與空白對照組相比，耳蝸干細胞移植組和干細胞移植+中藥干預組閾值出現輕微的下降，但3組閾值差異不大，無統計學意義。我們分析，這與在完成耳蝸干細胞移植后7 d干細胞分化為毛細胞的數量相應出現減少有關[15]。后面我們也從熒光顯微鏡下幾乎不見MyosinⅦA 陽性細胞而見到大量的Nestin 陽性細胞證實了我們的分析。另外我們發現，耳蝸干細胞在完成移植后開始大量的分化為毛細胞，在完成移植后30 d達到分化峰值，與耳蝸干細胞移植組比較，干細胞移植+中藥干預組的存活率及分化率都明顯升高，表明歸芪地黃湯干預能夠有效提高耳蝸干細胞的存活率以及分化為毛細胞的比例，具有臨床應用價值。

綜上所述，耳蝸干細胞移植聯合中藥干預對感音性耳聾治療效果明顯，歸芪地黃湯干預不僅可以明顯提高耳蝸干細胞的存活率，還可以明顯提高其分化為毛細胞的比例，具有臨床應用價值。

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