全基因組測序技術(shù)的發(fā)展及其在臨床微生物實驗室的應(yīng)用前景*

翟俊斌，曹小利 綜述，沈 瀚 審校

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗科，江蘇南京 210008)

隨著感染性疾病的治療在醫(yī)療環(huán)境中的重要性日益加強(qiáng)，微生物學(xué)實驗室通過提供鑒定、分析和追蹤病原體的相關(guān)信息，在感染控制中發(fā)揮著越來越重要的作用。隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，醫(yī)師需要對病原菌進(jìn)行快速準(zhǔn)確地鑒定。但由于病原體自身不斷變化(如耐藥性的改變，結(jié)核分枝桿菌復(fù)發(fā)等)，臨床偶然出現(xiàn)如病原菌無法培養(yǎng)等緊急情況，迫切需要微生物實驗室發(fā)展新技術(shù)，以預(yù)防醫(yī)療相關(guān)感染和提供最佳公共衛(wèi)生策略指導(dǎo)[1]。近年來，DNA測序技術(shù)進(jìn)入了基因組流行病學(xué)的新時代，使傳統(tǒng)分子診斷和基因分型方法得到加強(qiáng)，足以分析和比較整個病原體基因組，解析感染性疾病播散的方式和原因。這有助于監(jiān)測抗菌藥物耐藥的出現(xiàn)和播散，追蹤暴發(fā)感染調(diào)查，有較好的臨床微生物實驗室應(yīng)用前景。現(xiàn)從基因組學(xué)及其相關(guān)研究領(lǐng)域的發(fā)展、全基因組測序(WGS)在目前微生物研究的應(yīng)用進(jìn)展等方面，探討該技術(shù)在臨床微生物實驗室的應(yīng)用潛力。

1 基因組及基因組學(xué)

基因組是指包含在該生物的DNA(部分病毒是RNA)中的全部遺傳信息[2]。基因組學(xué)專注于基因組，對基因組進(jìn)行測序、組裝，以分析其結(jié)構(gòu)和功能，旨在對基因進(jìn)行集體特征和定量分析，是對基因、功能和相關(guān)技術(shù)的研究[3]，如重組DNA的應(yīng)用、DNA測序方法和生物信息學(xué)技術(shù)等。基因組學(xué)涉及DNA測序的應(yīng)用和隨后的分析，采用體外試驗和生物信息學(xué)方法來研究人類和病原體基因的結(jié)構(gòu)和功能。

2 WGS技術(shù)及其發(fā)展

WGS是在單一時間確定生物體基因組完整DNA序列的過程[4]。其通過生物信息手段，運(yùn)用高通量DNA測序儀來分析不同機(jī)體基因組間的結(jié)構(gòu)差異，并同時完成對單核苷酸多態(tài)性(SNP)及基因組結(jié)構(gòu)的注釋。第一代測序技術(shù)(Sanger測序)在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的過程中，不斷地在引物的3′端加入脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，使模板得以延伸，最終得到新的模板。而一旦在合成模板鏈的過程中添加了雙脫氧核苷酸(ddNTP)，其3′端缺少羥基，將無法再繼續(xù)延伸，PCR反應(yīng)就會終止[4]。該技術(shù)的產(chǎn)物將形成一系列由5′～3′ddNTP組成、長短不一的DNA片段。雖然有的片段長度能夠達(dá)到1 000 bp，且測序的準(zhǔn)確率高達(dá)99.999%，但該技術(shù)測序成本高、通量低，嚴(yán)重影響了WGS的效率。第二代測序技術(shù)則在Sanger測序的基礎(chǔ)上實現(xiàn)了高通量測序，一次可讀取10～100萬條序列，能快速、低成本地進(jìn)行大規(guī)模的基因組測序。第三代測序技術(shù)是指基于納米孔的單分子測序技術(shù)，不需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增，實現(xiàn)了對每一條DNA分子的單獨(dú)測序，具有快速、高效率、高精準(zhǔn)度等特點[5]。而DNA測序技術(shù)的快速發(fā)展，使得細(xì)菌基因組有可能在數(shù)小時內(nèi)完全測出，并能識別基因組的某些甲基化位點，這為細(xì)菌領(lǐng)域的科學(xué)研究提供了重要的研究方法。1995年，學(xué)者通過全基因組隨機(jī)測序法對流感嗜血桿菌的全基因組進(jìn)行了較為全面的分析，獲得了第一株微生物的全基因組數(shù)據(jù)，率先發(fā)布了第一株微生物的全基因圖譜。到目前為止，已有50個不同的細(xì)菌門和11個不同的古菌門基因組序列可用[6]。細(xì)菌基因組的測序已成為一個標(biāo)準(zhǔn)程序，而來自成千上萬種細(xì)菌的基因組信息使得學(xué)者對細(xì)菌世界有了更新的認(rèn)識。

3 基因組學(xué)的研究領(lǐng)域

3.1 功能基因組學(xué) 功能基因組學(xué)是利用基因組項目(如基因組測序項目)產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)來描述基因(蛋白質(zhì))功能及相互作用，以幫助理解整個生物體的基因和基因產(chǎn)物的性質(zhì)和功能，其目標(biāo)在于理解生物體的基因組與其表型之間的關(guān)系[7]。功能基因組學(xué)是將基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)知識擴(kuò)展、合成以理解單個生物體在細(xì)胞和(或)生物體水平上的動態(tài)特性。包括基因組本身的功能相關(guān)方面，例如突變和多態(tài)性(例如SNP分析)，分子活性的測量，涉及到基因、RNA和蛋白質(zhì)等隨時間或空間發(fā)生天然變異的研究，以及天然或試驗功能性破壞對基因、染色體、RNA或蛋白質(zhì)影響的研究。功能基因組學(xué)側(cè)重于動態(tài)方面(如基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用)，而不是基因組信息的靜態(tài)方面(如DNA序列或結(jié)構(gòu))。其試圖回答關(guān)于DNA在基因、RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和蛋白質(zhì)水平的功能問題，且回答方法均采用WGS方法(通常采用高通量測序方法)，而不是傳統(tǒng)的“基因-基因”方法。全基因組的知識為功能基因組學(xué)領(lǐng)域的研究提供了可能性，其主要涉及各種條件下的基因表達(dá)模式，最重要的研究工具是微陣列和生物信息學(xué)。

3.2 結(jié)構(gòu)基因組學(xué) 結(jié)構(gòu)基因組學(xué)試圖描述特定基因組編碼蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。這種方法可以聯(lián)合試驗和建模方法進(jìn)行高通量結(jié)果的結(jié)構(gòu)確定，目標(biāo)在于鑒定新的蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)[8]。結(jié)構(gòu)基因組學(xué)以多種方式，利用完整的基因組序列以確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。其與傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)預(yù)測間的主要區(qū)別在于，結(jié)構(gòu)基因組學(xué)試圖確定由基因組編碼的每個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，而不是集中在一個特定的蛋白質(zhì)；結(jié)構(gòu)基因組學(xué)采取大量方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)測定，包括使用基于基因組序列試驗方法、已知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的序列、結(jié)構(gòu)同源性的序列建模或與任何已知結(jié)構(gòu)無同源性蛋白質(zhì)的化學(xué)和物理原理進(jìn)行分析。

3.3 表觀遺傳學(xué) 表觀遺傳學(xué)是研究單個細(xì)胞遺傳物質(zhì)完整表觀遺傳修飾的學(xué)科，也稱為表觀基因組[9]。表觀遺傳修飾是對細(xì)胞DNA或組蛋白的可逆修飾，其影響基因表達(dá)而不改變DNA序列，在基因表達(dá)和調(diào)節(jié)中起重要作用，并且參與許多細(xì)胞過程。2個最具特征的表觀遺傳修飾是DNA甲基化和組蛋白修飾。

3.4 宏基因組學(xué) 宏基因組學(xué)是對宏基因組的研究，從環(huán)境樣品直接提取遺傳物質(zhì)。廣義領(lǐng)域也可被稱為環(huán)境基因組學(xué)，生態(tài)遺傳學(xué)或社區(qū)基因組學(xué)[10]。雖然傳統(tǒng)的微生物學(xué)和微生物基因組測序依賴于單個細(xì)菌培養(yǎng)，但早期環(huán)境基因測序克隆了特定基因(通常是16S rRNA基因)，可在自然樣品中產(chǎn)生多樣性譜。這表明絕大多數(shù)微生物的生物多樣性被傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法所遺漏。近年來，研究使用Sanger測序或大規(guī)模平行焦磷酸測序，對抽樣社區(qū)分離菌的所有基因進(jìn)行大量無偏見取樣，揭示了以前隱藏的微觀生命多樣性。因此，宏基因組學(xué)為觀察微生物世界提供了強(qiáng)大的鏡頭，有可能徹底改變?nèi)祟悓φ麄€生命世界的理解。

3.5 對比基因組學(xué) 對比基因組學(xué)是比較不同生物體的基因組特征(如DNA序列、基因、基因順序、調(diào)節(jié)序列等其他基因組結(jié)構(gòu)標(biāo)記)的學(xué)科。從基因組項目得到的基因組全部或大部分被比較以研究生物體之間的基本生物學(xué)相似性、差異及進(jìn)化關(guān)系[11-12]。比較基因組學(xué)的主要原理是2個生物的共同特征通常由它們之間進(jìn)化保守的DNA進(jìn)行編碼。因此，比較基因組方法開始于進(jìn)行某種形式的基因組序列比對，尋找比對基因組中的直向同源序列(共同祖先序列)，檢查這些序列保守的程度，并基于此進(jìn)行基因組和分子進(jìn)化的推斷--而這又可以放在群體遺傳學(xué)的表型進(jìn)化背景中進(jìn)行研究。自從1995年獲得了2種生物的整個基因組，比較基因組學(xué)已經(jīng)成為每個新基因組序列分析的標(biāo)準(zhǔn)組成部分。比較基因組學(xué)揭示了密切相關(guān)的生物體(例如人和黑猩猩)間高水平的相似性。更令人驚訝的是，看似遙遠(yuǎn)的相關(guān)生物體(例如人和酵母)之間的相似性，還表明基因組成在不同進(jìn)化譜系的極端多樣性。

通過應(yīng)用比較基因組學(xué)方法分析幾種相關(guān)病原體的基因組，可以開發(fā)多重保護(hù)的疫苗。一組研究人員已使用這種方法為B組鏈球菌(一組負(fù)責(zé)嚴(yán)重新生兒感染的細(xì)菌)創(chuàng)建了一種通用疫苗[13]。比較基因組學(xué)也可用于開發(fā)針對共生微生物的病原體特異性疫苗。例如，研究人員比較分析大腸桿菌共生菌和病原菌株的基因組用以鑒定病原體特異性基因，發(fā)現(xiàn)病原性菌株的特異性基因是免疫應(yīng)答抗原的基礎(chǔ)[14]。此外，對比基因組學(xué)有助于分析耐藥菌播散事件和爆發(fā)傳播，對于院內(nèi)感染控制有較好的指導(dǎo)意義。

4 公共基因組數(shù)據(jù)庫

WGS技術(shù)的快速發(fā)展及使用產(chǎn)生了大量的WGS數(shù)據(jù)。目前，國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)GenBank數(shù)據(jù)庫列出超過3 000個注釋完整的細(xì)菌基因組序列。同時，NCBI基因組數(shù)據(jù)與歐洲分子生物學(xué)實驗室(EMBL)、歐洲核苷酸檔案庫及日本DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ)共同形成了國際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫協(xié)作。而全球微生物識別倡議旨在協(xié)調(diào)微生物測序數(shù)據(jù)收集和整理集合基因組及元數(shù)據(jù)，以促進(jìn)全球范圍內(nèi)的后續(xù)分析。上述數(shù)據(jù)庫的發(fā)展和使用，為微生物領(lǐng)域的探索提供了大量寶貴數(shù)據(jù)。

5 WGS在臨床微生物檢驗中的應(yīng)用

5.1 潛在主要應(yīng)用 臨床微生物檢驗隨著科技的快速發(fā)展已經(jīng)有了較大進(jìn)步，仍面臨問題：(1)某些細(xì)菌無法被培養(yǎng)鑒定；(2)某些細(xì)菌(如結(jié)核分枝桿菌)需要長時間培養(yǎng)，影響患者的診斷治療；(3)隨著抗菌藥物的廣泛使用，多種細(xì)菌對抗菌藥物都出現(xiàn)耐藥，多藥耐藥甚至泛耐藥菌，使眾多患者因為耐藥而喪失生命，因此需要更強(qiáng)的分析工具提供更快、更全面的分析結(jié)果，以進(jìn)行更為有效的精準(zhǔn)治療。目前，WGS在診斷微生物實驗室中已有多個用于細(xì)菌病原體特征的主要潛在應(yīng)用。

5.1.1 細(xì)菌鑒定 目前臨床微生物實驗室常用的分離菌鑒定手段主要包括生化反應(yīng)API鑒定條、全自動鑒定儀器(如Vitek)、基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間(MALDI-TOF)、明確鑒定的16S rDNA 測序或特定核酸探針。但對于常規(guī)方法不能鑒定、不能或不容易培養(yǎng)的細(xì)菌，WGS可能有關(guān)鍵作用。有研究報道了通過下一代測序手段進(jìn)行神經(jīng)螺旋體病變的診斷[15]，突出了WGS在診斷微生物學(xué)中的潛在作用。此外，隨著WGS技術(shù)的發(fā)展，WGS正變?yōu)榕R床微生物學(xué)的常規(guī)工具。未來若能直接應(yīng)用于臨床樣品，可進(jìn)一步減少診療時間。HASMAN等[16]通過對疑似尿路感染患者的35例隨機(jī)尿樣進(jìn)行常規(guī)微生物學(xué)檢測、分離細(xì)菌的WGS及尿沉渣的WGS，以評估WGS直接對臨床標(biāo)本的適用性。結(jié)果顯示，19例標(biāo)本中分離出細(xì)菌，只有17株細(xì)菌是純培養(yǎng)。表明WGS可改進(jìn)培養(yǎng)細(xì)菌的鑒定，其觀察到的表型和預(yù)測的抗微生物敏感幾乎完全一致。培養(yǎng)菌和尿標(biāo)本沉渣直接測序的結(jié)果進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌和糞腸球菌在物種鑒定、多位點序列分型和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的結(jié)果完全一致。表明尿液標(biāo)本可以直接測序，并可在多微生物標(biāo)本中進(jìn)行細(xì)菌鑒定。此外，在某些培養(yǎng)陰性樣品中也觀察到其他推定性的病原菌株。這表明，WGS可直接對臨床標(biāo)本提供相關(guān)信息，大大減少診斷時間。不過，臨床實施會進(jìn)行大量的數(shù)據(jù)分析，需要開發(fā)相應(yīng)的生物分析學(xué)軟件。

5.1.2 細(xì)菌分型 常規(guī)細(xì)菌分型的方法包括脈沖場凝膠電泳(PFGE)、多位點序列分型(MLST)、細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR(REP-PCR)、腸桿菌基因間重復(fù)共有序列PCR(ERICR-PCR)、血清型分型等，這些方法較難提供更全面的分析信息。WGS通過計算機(jī)模擬分型和優(yōu)越的判別能力就能較好地克服上述問題。例如，MLST是進(jìn)行管家基因擴(kuò)增測序分析；而全基因組分析技術(shù)將WGS讀數(shù)映射到基因的參考序列，或使用基本局部比對搜索工具(BLAST)鑒定管家基因的等位基因，以明確菌株序列分型。WGS高度的鑒別能力促使它成為菌株對比中新的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法，在疾病播散推斷方面超越了傳統(tǒng)的分型方法。研究表明，基于等位基因突變或基因水平的差異(例如血清分型和病理形成),WGS可精確測定大腸桿菌亞型，提供關(guān)于大腸桿菌核心基因組中的SNP信息，形成序列分型的基礎(chǔ)，也能比其他系統(tǒng)更可靠地跟蹤個體菌株的進(jìn)化和傳播[17]。這對于細(xì)菌病原體流行病學(xué)監(jiān)測、感染控制和爆發(fā)流行的調(diào)查具有重要作用。

5.1.3 耐藥基因檢測 傳統(tǒng)的耐藥基因檢測主要結(jié)合耐藥表型進(jìn)行耐藥基因的擴(kuò)增、檢測、測序分析。盡管關(guān)鍵基因如rpoB的特征性突變也可用抗性表型的預(yù)測進(jìn)行檢測，但隨著生物信息學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，WGS數(shù)據(jù)已可以較容易地檢測獲得性耐藥基因(如β-內(nèi)酰胺酶和氨基糖苷修飾酶)[18-19]。然而，上述方法目前仍不能可靠地預(yù)測某些耐藥機(jī)制(例如，由ampD，ampR和ampC等調(diào)節(jié)基因的去阻遏所引起的耐藥，或由graRS，vraSR、walKR，agr和rpoB的復(fù)合調(diào)節(jié)系統(tǒng)突變所賦予的萬古霉素異質(zhì)性耐藥)。微生物培養(yǎng)及敏感性測試方法更為快速可靠，而WGS對于緩慢生長的細(xì)菌、不能培養(yǎng)的細(xì)菌及敏感性結(jié)果不可靠的細(xì)菌更有用。

5.1.4 毒力譜分析 WGS數(shù)據(jù)的另一個主要潛在用途是檢測毒力的遺傳標(biāo)記(如大腸桿菌中的志賀毒素)[19-20]，但由于基因存在的意義及基因表達(dá)的不確定性，這有待于進(jìn)一步研究。

5.1.5 難培養(yǎng)細(xì)菌的分析 近幾十年來，艱難梭菌感染已成為全球公共衛(wèi)生威脅。由于難以培養(yǎng)，艱難梭菌仍然是一個較少了解的病原體。然而，WGS技術(shù)使得艱難梭菌的基因組得以分析，使醫(yī)師獲得關(guān)于毒力、進(jìn)化和遺傳相關(guān)性的大量基因組數(shù)據(jù)[21]。此外，WGS還在小規(guī)模和大規(guī)模應(yīng)用中展示了對暴發(fā)和疾病傳播方面研究的卓越性,具有較好的應(yīng)用價值。

5.2 WGS的局限性 雖然WGS技術(shù)帶來了新的工具，但仍然存在著某些缺陷。(1)目前，大多數(shù)分析通過比較參考基因組序列來鑒定單核苷酸變體或SNP。因此，分析結(jié)果受測序、基因組裝配質(zhì)量、參考基因組的質(zhì)量和選擇等方面的影響。(2)用于臨床目的的比較基因組方法應(yīng)旨在利用更少的時間進(jìn)行更有效的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系估計，其結(jié)果可能不是最準(zhǔn)確的，但是具有足夠的分辨率和準(zhǔn)確性以用于臨床和公共衛(wèi)生決策。但在計算資源及時間要求方面，目前較難用于臨床。(3)WGS數(shù)據(jù)可用于提供詳細(xì)的時間基因組信息，這不一定能轉(zhuǎn)化為基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄的知識，因此對于臨床應(yīng)用有一定局限性，需要生物信息學(xué)軟件等的進(jìn)一步發(fā)展。(4)雖然WGS技術(shù)及分析工具發(fā)展快速，但目前主要用于參考實驗室，沒有大規(guī)模地用于臨床實驗室，缺乏在臨床研究中的驗證和效用比較。

6 展 望

近幾十年來，基因組學(xué)已被廣泛用于感染菌研究。隨著下一代高通量測序技術(shù)的發(fā)展，研究人員將能大規(guī)模詳細(xì)地分析整個病原體基因組，在短時間內(nèi)完成微生物的鑒定及藥敏試驗，可更完整、快速、準(zhǔn)確地了解臨床微生物的耐藥情況，為臨床及時提供用藥指導(dǎo)。另外，WGS還可克服藥敏鑒定儀等數(shù)據(jù)庫不完整和過時的缺點，避免誤診，為臨床微生物實驗室提供可靠的流行病學(xué)資料，對院內(nèi)感染的控制和預(yù)防具有非常重要的作用。目前，由于全基因組實施的成本高、經(jīng)驗缺乏及生物學(xué)分析工具的缺乏，WGS大多在參考實驗室實行。然而，隨著測序技術(shù)及生物學(xué)信息的快速發(fā)展，相信上述問題將很快被克服，WGS或?qū)⒃诓痪玫膶硖娲⑸锏膫鹘y(tǒng)檢測方法，快速應(yīng)用于臨床。

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